董艷輝，趙興華，李亞莉，王亦學(xué)，任永康，王長彪，唐朝暉

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西 太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031）

花藥培養(yǎng)是獲得小麥加倍單倍體植株的重要途徑之一，也是生物技術(shù)育種中較為成熟的技術(shù)之一，其產(chǎn)生的后代是進行遺傳育種研究和培育新品種的優(yōu)良材料。小麥花藥培養(yǎng)自20世紀70年代開始獲得花藥培養(yǎng)植株以來，在理論和應(yīng)用研究方面取得了長足的發(fā)展，其技術(shù)體系已經(jīng)相對比較完善和成熟，已經(jīng)成為小麥常規(guī)育種技術(shù)的重要補充?？蒲腥藛T利用該技術(shù)已經(jīng)獲得豫麥37號、豫麥60號、京花1號、花培764、花培1號、京花10號、花培3號、花培5號、花培6號、奎花1號、陜農(nóng)28等小麥新品種，其中，花培5號為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2006年審定的國審品種。多年來，國內(nèi)外的科研工作者圍繞小麥花藥培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)開展了多方面研究，諸如，基因型、培養(yǎng)基成分、預(yù)處理、染色體加倍等。研究表明，小麥花藥培養(yǎng)還受上述諸多因素的限制。

筆者綜述了小麥花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)，討論了不同影響因子的最新研究進展，以期為提高小麥花藥培養(yǎng)效率提供參考。

1 基因型

小麥花藥培養(yǎng)受各種因子的影響，如基因型、培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件等，其中，基因型是影響花藥培養(yǎng)效率諸多因素中主要的影響因素。TORP等[1-2]研究表明，多種遺傳效應(yīng)影響小麥花藥的培養(yǎng)力，表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，包括顯性效應(yīng)、互作效應(yīng)、胞質(zhì)效應(yīng)、加性效應(yīng)和核質(zhì)互作效應(yīng)等。任慧莉等[3]研究表明，相同培養(yǎng)條件下，不同基因型小麥花藥培養(yǎng)一步成苗的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、白苗分化率及綠苗產(chǎn)量等也不同。蔡正云等[4]研究認為，小麥基因型對花培效率的影響是多方面的，基因型對綠苗分化、愈傷組織的產(chǎn)生、白化苗的產(chǎn)生都有一定程度的影響，并且基因型不同，影響的方面也不盡相同。該研究結(jié)果與任慧莉等[3]的研究結(jié)果基本一致。徐龍珠等[5]研究認為，花培中母本基因型對誘導(dǎo)率的影響大于父本，即存在細胞質(zhì)效應(yīng)，把性狀優(yōu)良、誘導(dǎo)率高的材料作為母本進行組配，可以提高雜交后代花培誘導(dǎo)率。呂學(xué)蓮等[6]對寧春4號進行正反交的培養(yǎng)力試驗，結(jié)果也表明，母本效應(yīng)大于父本效應(yīng)；同時提出利用高培養(yǎng)力的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)橋梁基因型，在很大程度上可以提高花藥培養(yǎng)效率。韓曉峰等[7]利用小麥花藥培養(yǎng)力強的基因型Alondra做父本的試驗結(jié)果表明，親本中只要有一個花藥培養(yǎng)力高，其雜交組合后代花藥培養(yǎng)力一般都較高，表現(xiàn)為顯性效應(yīng)；但是如果親本雙方花藥培養(yǎng)力都很高，其雜交組合后代的花藥培養(yǎng)力反而不一定很高，表現(xiàn)為互作效應(yīng)。

基因型對小麥花藥培養(yǎng)的影響是可遺傳的性狀，因此，加強對具有優(yōu)良生物學(xué)性狀和培養(yǎng)力強的小麥基因型進行篩選作為橋梁親本，是提高雜交后代的花藥培養(yǎng)效率比較有效的途徑之一，對進一步提升花藥培養(yǎng)技術(shù)在小麥生物技術(shù)育種中的地位有很大的現(xiàn)實意義。目前，通過國內(nèi)外的花培育種家們的潛心研究，已經(jīng)篩選出一批農(nóng)藝性狀優(yōu)良、花培效率高的優(yōu)良小麥基因型材料，國外品種有 Verry，Lagwa，Zadra，Sumai 3，Saptdhara，Noria 73，F(xiàn)lorida，Orofen，Chris等，國內(nèi)有京東 8 號、寧春 4 號、新春9號、溫6、隴春27號、周麥16號等。

2 培養(yǎng)基

2.1 基本培養(yǎng)基

小麥花藥培養(yǎng)效率的提高，在很大程度上是依賴于培養(yǎng)基成分、配比以及附加成分的改變來實現(xiàn)的，可以說培養(yǎng)基的改良一直處于主導(dǎo)地位。經(jīng)過前人的多年研究，小麥花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基歷經(jīng)了馬鈴薯，N6，MS，W14，C17，K3，K（癸培養(yǎng)基）等[8-13]，培養(yǎng)效率也逐步提高，其中，目前常用的培養(yǎng)基主要有 W14，C17，K 培養(yǎng)基等。陳保峰[14]用 N6，C17，MS這3種培養(yǎng)基對豫麥57號、小偃22、鄭麥9023等3個品種進行花藥培養(yǎng)對比試驗，結(jié)果表明，C17培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯優(yōu)于N6和MS培養(yǎng)基。楊雪等[15]用C17和K培養(yǎng)基對128個黃淮麥區(qū)雜交組合進行花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明，K培養(yǎng)基對小麥花藥愈傷組織的平均誘導(dǎo)率較C17培養(yǎng)基提高了90.2%，穩(wěn)定性更強，這與張再君等[16]的研究結(jié)果不太一致，可能存在供試材料基因型不一樣導(dǎo)致對培養(yǎng)基的反應(yīng)不同，存在著基因型與培養(yǎng)基的互作機制，因此，K培養(yǎng)基可能更適用于黃淮麥區(qū)的花藥培養(yǎng)，進一步研究表明，K培養(yǎng)基中的NH4+濃度低可能是其花藥培養(yǎng)率高的一個影響因素。呂學(xué)蓮等[17]用C17和W14固體培養(yǎng)基對103份供試小麥材料進行花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明，C17培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率達到W14培養(yǎng)基的2倍，差異較大，進一步研究表明，C17培養(yǎng)基的綠苗分化率也高于W14培養(yǎng)基，而白化苗分化率方面二者差異不大。

2.2 附加成分

隨著小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，前人對小麥花藥培養(yǎng)的影響因素的研究也進一步細化和深入，尤其是對培養(yǎng)基附加物的類型、含量和配比的研究及改良，大大提高了小麥花藥培養(yǎng)率，因此，附加物成分的改變可能是花藥培養(yǎng)效率提高的一個至關(guān)重要的突破口。目前，最常見且被廣泛應(yīng)用的附加物成分有2，4-D、苯乙酸（PAA）、多效唑（MET）、ABA（脫落酸）、脯氨酸、谷氨酰胺、秋水仙素以及植物器官、組織和細胞提取液等，它們對愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率產(chǎn)生的效果已經(jīng)被廣泛證實，但是具體的機理還有待進一步的研究。張廷紅等[18]在小麥分化培養(yǎng)基中加入4 mg/L AgNO3的研究表明，花藥愈傷組織的分化率和綠苗率最高，組織分化率可以達到56.65%，該結(jié)果與在黃瓜中研究的結(jié)果一致。李文卓等[19]研究認為，在小麥花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基C17中加入6-BA和2，4-D形成的愈傷組織，其誘導(dǎo)、分化以及染色體加倍率都比較高，且以2，4-D和6-BA的體積比為2∶1效果最佳。王煒等[20]研究認為，在小麥基本培養(yǎng)基W14中加入阿拉伯半乳糖（AGP）可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，這與前人在植物小孢子培養(yǎng)過程中加入子房共培養(yǎng)或者加入子房提取液共培養(yǎng)能夠提高小孢子培養(yǎng)率的研究結(jié)果一致。陳保峰[14]在基本培養(yǎng)基N6和C17中加入10%的椰子汁后，2種培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率都顯著提高，同時也表明，C17培養(yǎng)基中加入脯氨酸也能提高愈傷組織誘導(dǎo)率，其最佳濃度為5.0mmol/L。史勇等[21]在癸培養(yǎng)基中加入0.9mg/L的稀土（rare eaxth addition）后，小麥花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率大大提高，最高可達64.07%。海燕等[9，20]進一步研究表明，分化培養(yǎng)基中加入稀土后也可顯著提高綠苗分化率，由于稀土成分比較復(fù)雜，其作用機理還有待進一步研究[10，22]。除了上述培養(yǎng)基附加物外，還有一部分附加物，它們對小麥花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不大，但是對綠苗的分化率有顯著的提高作用，如N-苯基-N′-（2-氯 -4吡啶基）脲（4PU-30）、脫落酸（ABA）等，還有研究表明，在培養(yǎng)基中加入器官提取液或者用子房與花藥共培養(yǎng)都可以顯著提高花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率。

3 培養(yǎng)條件

小麥花藥培養(yǎng)過程中，溫度和光照也是不可忽視的影響因素。呂雪蓮等[17]對不同基因型小麥花藥高溫暗培養(yǎng)時間進行研究，結(jié)果表明，高溫培養(yǎng)比不進行高溫培養(yǎng)的愈傷誘導(dǎo)率高，不同基因型的高溫暗培養(yǎng)的最適宜時間不同，還需要大量的基因型材料通過試驗加以驗證。歐陽俊文等[23]對小麥不同的親本和F1進行花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度受基因型的影響，并且這一特性是可以遺傳的，進一步研究表明，該遺傳是受多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，同時認為高溫培養(yǎng)雖然提高了小麥愈傷組織的誘導(dǎo)率，但是降低了綠苗分化率。倪勝利等[24]對旱作小麥花藥培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)初期32℃高溫下培養(yǎng)10 d，可以顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率。

溫度和光照是影響小麥花藥培養(yǎng)不可忽視的因素之一，因此，優(yōu)化不同基因型的最佳培養(yǎng)溫度和最適宜的光照時間可以進一步提高小麥花藥培養(yǎng)效率，同時小麥花藥接種前期的低溫預(yù)處理也是影響因素之一，但是低溫處理的時間因基因型的不同而稍有不同。宋運賢等[25]以10個普通小麥品種（系）和16個雜交F1作為研究對象，結(jié)果表明，小麥花藥接種前低溫預(yù)處理0.5 d，花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗誘導(dǎo)率為最佳，超過8 d后低于對照。前人研究進一步表明，低溫預(yù)處理時間與基因型有關(guān)，不同的基因型低溫預(yù)處理的最佳時間不同。

4 討論及展望

目前，我國利用小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)育成50多個省審乃至國審小麥品種和一大批優(yōu)良的種質(zhì)遺傳材料，在生物技術(shù)育種技術(shù)中，小麥花藥培養(yǎng)已成為系統(tǒng)的、成熟的小麥育種技術(shù)方法，利用該技術(shù)創(chuàng)建的小麥加倍單倍體（DH）群體在小麥分子遺傳研究中發(fā)揮了重要作用，同時，通過該技術(shù)與其他育種技術(shù)相結(jié)合，如輻射誘變、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和遠緣雜交等，進一步豐富了小麥遺傳材料，總之，小麥花藥培養(yǎng)充分地顯示了其在小麥分子研究和育種實踐中的重要利用價值。但是花培品種與常規(guī)育種品種相比，雖然也有一定數(shù)量的國審品種，但在實際生產(chǎn)中能夠較大面積推廣種植的品種還較少，沒有能夠充分發(fā)揮其優(yōu)勢。其原因是多方面的，存在顯著的基因型依賴性、綠苗分化率較低、花藥接種過程較為繁瑣，同時，單倍體加倍率不高和與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合程度不高，也是限制其發(fā)展的主要因素。因此，大范圍收集、篩選具有優(yōu)良花培特性的小麥基因型材料是發(fā)展花藥培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵所在；進一步提高花培效率，優(yōu)化培養(yǎng)流程，重視與常規(guī)育種技術(shù)的結(jié)合，加強技術(shù)和育種材料的交流能夠進一步推動花藥培養(yǎng)技術(shù)的進一步發(fā)展；最后加強與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（分子標記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因）相結(jié)合，從分子水平上提升花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)效率，提升研究水平。

隨著下一代測序技術(shù)、高通量篩選突變體等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，小麥加倍單倍體材料（DH）的創(chuàng)制就顯得尤為重要。花藥培養(yǎng)技術(shù)與誘變技術(shù)、遠緣雜交等技術(shù)的相互補充，將會在加快小麥突變體、雜合體的純合，在優(yōu)良材料中篩選抗性分子標記方面發(fā)揮應(yīng)有的作用。通過幾十年的不懈努力，我國在小麥花藥培養(yǎng)研究某些方面處于國際領(lǐng)先地位，但是存在各個領(lǐng)域的研究人才團隊建設(shè)不合理，研究材料共享渠道不暢通等問題。因此，加強不同領(lǐng)域科研人員的團隊建設(shè)、建立小麥優(yōu)良材料種質(zhì)資源庫，培養(yǎng)具備多項知識和技術(shù)的人才隊伍，這將會有力助推我國在相關(guān)領(lǐng)域的研究水平，使我國原本具有優(yōu)勢的小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)趕超國外。

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