石軍梅，劉英，劉義冰，王曉翔，劉純一

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050000)

肝癌是我國(guó)發(fā)病率排名前五的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致患者死亡的主要癌癥之一[1]。肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素包括乙肝、丙肝、酒精肝、脂肪肝、遺傳或基因突變等[2]。雖然肝癌的診療技術(shù)已取得了巨大的進(jìn)步，但是因其具有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高及易耐藥等特點(diǎn)，仍缺乏有效的治療手段[3]，導(dǎo)致病死率居高不下。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)密切相關(guān)，腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐藥均有CSCs的參與[4]。肝癌干細(xì)胞是CSCs的一種，具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化能力的細(xì)胞，是腫瘤無(wú)限生長(zhǎng)的主要原因，也是惡性腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐藥的根本原因[6,7]。目前，肝癌干細(xì)胞分選及鑒別的常用表面分子標(biāo)志物有跨膜酪氨酸激酶受體蛋白(CD117、CD133、CD90、CD44)和上皮細(xì)胞黏附分子等，其中以CD133為分選標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞分選技術(shù)可分選出肝癌干細(xì)胞，該方法也是常用的肝癌干細(xì)胞識(shí)別、分選的方法[8,9]。KLF8基因是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的誘導(dǎo)蛋白，其表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展密切相關(guān)，也可刺激和促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌[10,11]。KLF8基因在肝癌組織中高表達(dá)，與肝癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展呈一定程度的正相關(guān)[12]。我們推測(cè)，通過(guò)慢病毒質(zhì)粒敲除肝癌干細(xì)胞中KLF8基因的表達(dá)將可能抑制肝癌的惡性進(jìn)展，但以往鮮有報(bào)道。本研究觀察了抑制KLF8基因表達(dá)對(duì)肝癌干細(xì)胞干性表型、體內(nèi)成瘤及肺轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為肝癌患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或治療耐藥提供新的臨床治療思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FITC標(biāo)記的CD133抗人抗體及PE標(biāo)記的對(duì)照抗體(BD，USA)，KLF8基因的干擾慢病毒載體質(zhì)粒sh-KLF8及對(duì)照空載體質(zhì)粒sh-control(GeneCopoeia構(gòu)建，USA)，兔抗人KLF8抗體(CST，USA)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑(Invitrogen，USA)，RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems，USA)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies，UK)，qSYBR-Green-containing PCR試劑盒(Qiagen，USA)，Dako兩步法免疫組化試劑盒(Dako，丹麥)。Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)413MBY042078)，奧林巴斯倒置顯微鏡Olympus IX71(Olympus公司，日本，CCD圖像傳感器，配合Image-Pro Plus7.0成像系統(tǒng)使用)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Thermo，Nanodrop 2000，USA)，BD FACSAriaTM流式細(xì)胞分選儀(BD，USA)。

1.2 原代肝癌細(xì)胞的分離及干細(xì)胞球的培養(yǎng) ①肝癌肺轉(zhuǎn)移樣本收集及原代肝癌細(xì)胞分離：選取手術(shù)切除的肝癌肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本(經(jīng)病理科確診)，將組織樣本于無(wú)菌體條件下迅速置于RNAlater保存液中，并立即保存于-80 ℃以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)的所有過(guò)程均遵從赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，該研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且在充分告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)后與該患者簽署了知情同意書。取人肝癌肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本約2.5 cm3，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，漂洗2次，3 min/次，將組織剪成約1 mm3的小塊，加入1%膠原消化液消化0.5 h，將細(xì)胞懸液過(guò)0.45 μm的細(xì)胞篩，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，共離心2次，上清液的重懸采用DMEM培養(yǎng)基。最后調(diào)整單細(xì)胞懸液的濃度為106個(gè)/mL，取3 mL單細(xì)胞懸液接種到25 mL的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。每天顯微鏡下觀察干細(xì)胞球的形成情況，約2周后開始有細(xì)胞球形成，收集流式細(xì)胞儀分選出的CD133+表型的LCSCs，無(wú)血清懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)。②干細(xì)胞球培養(yǎng)：無(wú)血清培養(yǎng)基由DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、表皮生長(zhǎng)因子(20 ng/mL)1 mL和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(20 ng/mL)500 μL組成。經(jīng)流式分選出的CD133+表型的肝癌干細(xì)胞均培養(yǎng)于含無(wú)血清培養(yǎng)基的低吸附六孔板中，細(xì)胞均置于37 ℃，飽和濕度，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每5 d加1.5 mL的新鮮培養(yǎng)基以補(bǔ)充干細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)干細(xì)胞球數(shù)量達(dá)到約200～300個(gè)時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 KLF8基因RNA干擾重組慢病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及感染LCSCs KLF8基因RNA干擾重組慢病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 含KLF8基因干擾的重組慢病毒質(zhì)粒(sh-KLF8)及其陰性對(duì)照慢病毒空載體質(zhì)粒(sh-control)是由美國(guó)的GeneCopoeia公司構(gòu)建(均帶egfp的熒光標(biāo)簽)。將20 μg重組質(zhì)粒，15 μg pCMV-delta R8，6 μg PLVX-AcGFP稀釋至500 μL雙蒸水，加入2×HBS 500 μL及50 μL氯化鈣，靜置0.5 h后滴入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，40 h后收集上清液，經(jīng)離心微孔濾器過(guò)濾后分裝，病毒液-80 ℃保存。同法獲得對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的病毒液。LCSCs感染：將兩種病毒液分別以病毒/細(xì)胞數(shù)量=18∶1的比例感染經(jīng)流式分選鑒定的LCSCs，感染3 d后觀察熒光的表達(dá)量，并加入2.0 μg/mL的嘌呤霉素，繼續(xù)培養(yǎng)，直到所有細(xì)胞均可觀察到熒光的表達(dá)。

1.4 肝癌干細(xì)胞CD133+表型細(xì)胞亞群比例檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將收集的細(xì)胞室溫下離心，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。PBS清洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，使用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105，將調(diào)整濃度后的細(xì)胞平均分為兩份，分別將其移至流式管中，一份加入CD133-FITC抗體，一份中加入PE標(biāo)記的對(duì)照抗體，各加入10 μL，分別加入阻斷劑20 μL，緩沖buffer 80 μL，將上述試劑充分混勻后，4 ℃條件下避光靜置15 min，將標(biāo)記后的細(xì)胞離心，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗1次，棄上清，上機(jī)檢測(cè)CD133+表型細(xì)胞亞群的比例，上機(jī)分選出CD133+表型的肝癌干細(xì)胞細(xì)胞亞群，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)消化，離心，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入1 mL TRIzol，室溫孵育15 min，裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上孵育15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，緩慢取上清，避免吸入中間層的白色物質(zhì)，上層水相體積約為所用TRIzol試劑的60%，將吸取的上清置于另一干凈EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA，顛倒混勻，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，見(jiàn)RNA沉淀附著于EP管，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μL無(wú)RNase水溶解，取1 μL測(cè)RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20 ℃保存?zhèn)溆?。以上述提取的?xì)胞總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，在BioRad IQTM5 Multicolor實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)上檢測(cè)各組的Ct值并記錄。KLF8引物由Invitrogen公司合成，GAPDH為內(nèi)參，KLF8的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt來(lái)表征，ΔΔCt=(CtKLF8-CtGAPDH)target-(CtKLF8-CtGAPDH)control。反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 肝癌干細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力及肺轉(zhuǎn)移能力觀察 ①體內(nèi)成瘤能力：實(shí)驗(yàn)用BALB/c免疫缺陷型裸鼠(SPF級(jí))共10只，2～4周齡，雌性，體質(zhì)量(20.3±2.7)g。飼養(yǎng)在恒溫(20～26 ℃)、恒濕(50%～56%)、無(wú)特定病原體的空氣潔凈層流架內(nèi)，按SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行喂養(yǎng)。裸鼠分為L(zhǎng)CSCssh-LIFR組和LCSCssh-control組，每組各5只，將構(gòu)建的穩(wěn)定干擾KLF8及其陰性對(duì)照肝癌干細(xì)胞株LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control分別經(jīng)皮下注射到裸鼠體內(nèi)，注射量為每只5×102，共100 μL。4周后處死裸鼠并解剖，取出瘤體，稱量瘤體的重量，該實(shí)驗(yàn)的所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。②肺轉(zhuǎn)移能力：實(shí)驗(yàn)用BALB/c免疫缺陷型裸鼠(SPF級(jí))共10只，實(shí)驗(yàn)分LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control兩組(每組各5只)，將構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control分別經(jīng)尾靜脈注射到兩組裸鼠體內(nèi)，注射量為每只1×102，共50 μL。4周后處死裸鼠并解剖，取出肺組織，HE染色，鏡下統(tǒng)計(jì)肺組織中所有轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)。免疫組化法檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移灶中KLF8蛋白，標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后常規(guī)石蠟切片，經(jīng)脫蠟及水化后常規(guī)免疫組化染色(按照Dako兩步法免疫組化試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作)，中性樹膠封片晾干，顯微鏡下采集200×的圖像，KLF8蛋白表達(dá)的定性研究采用直接觀察是否在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(陽(yáng)性著色為紅棕色)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌干細(xì)胞的形態(tài)及感染結(jié)果 肝癌患者的肺轉(zhuǎn)移灶經(jīng)體外分離、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)及CD133+分選得轉(zhuǎn)移性LCSCs，鏡下觀察無(wú)血清懸浮培養(yǎng)下的LCSCs，發(fā)現(xiàn)LCSCs肝癌干細(xì)胞球圓而亮，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。分別穩(wěn)定感染敲除KLF8基因及其陰性對(duì)照慢病毒質(zhì)粒到LCSCs干細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察到LCSCs干細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，隨著感染時(shí)間的增加，LCSCs細(xì)胞中熒光的表達(dá)量不斷增加，最終熒光表達(dá)率均達(dá)90%以上時(shí)表明細(xì)胞株構(gòu)建成功。qRT-PCR結(jié)果顯示，與LCSCssh-control細(xì)胞(1.032±0.031)比較，LCSCssh-KLF8干細(xì)胞(0.230±0.032)中KLF8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)。該結(jié)果進(jìn)一步表明穩(wěn)定敲除KLF8的LCSCssh-KLF8及其對(duì)照干細(xì)胞LCSCssh-control構(gòu)建成功。

2.2 兩組CD133+表型細(xì)胞亞群比例比較 LCSCssh-control組和LCSCssh-KLF8組CD133+表型細(xì)胞亞群比例分別為54.71%±1.13%、1.03%±0.03%，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組裸鼠體內(nèi)成瘤能力比較 LCSCssh-KLF8組和LCSCssh-control組裸鼠成瘤重量分別為(1.60±0.38)、(6.57±0.25)g，兩組比較，P<0.05。

2.4 兩組裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力比較 LCSCssh-KLF8組和LCSCssh-KLF8組裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)分別為(21.00±0.71)、(1.00±0.31)，兩組比較，P<0.05。

3 討論

肝癌是全球病死率排名第三，發(fā)病率排名第五的惡性腫瘤[13]。目前，肝癌的一線治療手段為肝移植或手術(shù)切除，但肝癌的易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)使得一線治療常常對(duì)于該類患者并無(wú)明顯的效果，長(zhǎng)期預(yù)后也不能令人滿意，晚期肝癌患者的二線治療常采用動(dòng)脈化療栓塞或全身化療途徑，但由于肝癌腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生化學(xué)耐藥，且傳統(tǒng)化療藥物的毒性，常導(dǎo)致治療方案的療效有限及使用受限[14,15]。大量研究[16]顯示，腫瘤細(xì)胞中存在一小部分可維持腫瘤細(xì)胞異常生長(zhǎng)的亞群，這群細(xì)胞具有無(wú)限增殖分裂和多向分化的能力，該類細(xì)胞被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因，這類細(xì)胞即為CSCs。因此，在肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者的治療中，應(yīng)該將肝癌CSCs作為腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療的重要靶向細(xì)胞，尋找靶向CSCs的靶點(diǎn)，并對(duì)該靶點(diǎn)進(jìn)行有效的干預(yù)將是治療肝癌腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

CD133蛋白是人類造血干/祖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種5次跨膜糖蛋白，其表達(dá)特點(diǎn)為隨著細(xì)胞分化而迅速下調(diào)，該特點(diǎn)使CD133成為鑒定和分離CSCs的一個(gè)特異性分子標(biāo)志[17]，CD133是肝癌、前列腺和黑素瘤等多種腫瘤的CSCs標(biāo)志之一[18～20]。本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)從轉(zhuǎn)移性肝癌患者的肺轉(zhuǎn)移灶中分離并培養(yǎng)出原代細(xì)胞，經(jīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)形成肝癌轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞球，以CD133為肝癌干細(xì)胞的分選標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞分選技術(shù)分選出CD133+表型的轉(zhuǎn)移性肝癌干細(xì)胞細(xì)胞亞群LCSCs，后經(jīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法富集肝癌干細(xì)胞，該方法可行性高，富集的肝癌干細(xì)胞也較為可靠。

文獻(xiàn)[21,22,12]報(bào)道，KLF8在多種腫瘤中存在表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象，如KLF8在卵巢癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和肝癌的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中均存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。在肝癌中KLF8的過(guò)表達(dá)與肝癌患者的疾病惡性程度或惡性進(jìn)展如淋巴結(jié)陽(yáng)性狀態(tài)、腫瘤分級(jí)增加、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加及總體生存的降低等密切相關(guān)[23,24]。為了進(jìn)一步挖掘KLF8及CSCs在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及治療耐藥中的作用，探究KLF8對(duì)肝癌干細(xì)胞干性表型及體內(nèi)成瘤及肺轉(zhuǎn)移能力的影響，我們決定采用慢病毒質(zhì)粒敲低肝癌干細(xì)胞中KLF8的表達(dá)，以觀察上述過(guò)程中的變化。通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒抑制KLF8的表達(dá)，篩選并成功構(gòu)建了穩(wěn)定抑制KLF8的穩(wěn)轉(zhuǎn)甲狀腺癌干細(xì)胞株LCSCssh-KLF8及其對(duì)照干細(xì)胞株LCSCssh-control，鏡下觀察LCSCssh-KLF8和LCSCssh-control中細(xì)胞的熒光表達(dá)量，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中KLF8 mRNA，我們也進(jìn)一步驗(yàn)證了該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

本研究顯示，敲除KLF8的確可以降低LCSCs肝癌干細(xì)胞中的CD133+表型細(xì)胞亞群的比例，減少裸鼠體內(nèi)的成瘤重量和肺轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)。該結(jié)果表明在肝癌干細(xì)胞中敲除KLF8可以降低代表肝癌干細(xì)胞干性表型的CD133，即抑制KLF8使肝癌干細(xì)胞的干性表型降低，降低肝癌干細(xì)胞的成瘤和肺轉(zhuǎn)移能力。對(duì)于敲低KLF8可降低干細(xì)胞干性表型、降低體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移能力的原因，結(jié)合已有研究，由于多種腫瘤在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，即存在上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程可顯著降低鈣黏蛋白(E-cadherin)介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附，使細(xì)胞的上皮形態(tài)喪失，并獲得侵襲性更強(qiáng)的成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)細(xì)胞表型，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程和E-cadherin的作用密切相關(guān)，E-cadherin功能缺失會(huì)使腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加，該過(guò)程使腫瘤細(xì)胞擁有干細(xì)胞特征、減少細(xì)胞的凋亡和衰老，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制[25,26]。在腫瘤發(fā)生的初期階段，上皮細(xì)胞經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)樵话?，后續(xù)腫瘤細(xì)胞經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程向周圍組織擴(kuò)散，并經(jīng)血管或淋巴管向遠(yuǎn)處組織發(fā)生遷移，最終形成轉(zhuǎn)移灶[27,28]。而我們知道KLF8是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的誘導(dǎo)蛋白，KLF8可顯著抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白E-cadherin的表達(dá)，與E-cadherin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，和細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)[10,12]，另外KLF8也可顯著刺激和促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，促進(jìn)微血管的形成[11]。因此，我們推測(cè)敲低KLF8可降低干細(xì)胞干性表型、降低體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移能力的具體原因，可能是因?yàn)榍玫蚄LF8導(dǎo)致KLF8介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程和促進(jìn)腫瘤微血管形成的過(guò)程被抑制而引起的。

總之，抑制KLF8可顯著抑制肝癌干細(xì)胞的干性表型和體內(nèi)成瘤、肺轉(zhuǎn)移能力，因此研發(fā)靶向敲除KLF8的藥物將可能為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性肝癌的臨床治療提供新的思路。