陳印，顧鵬，李秋艷，李顯永，柯坤彬

(1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032；2昆明醫(yī)科大學(xué))

膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一，在全世界癌癥發(fā)病率中排第7位，男女發(fā)病比例3.5∶1，發(fā)病高峰年齡50～70歲。盡管目前有多種治療方法，但有50%～70%的表淺性膀胱癌會復(fù)發(fā)，10%～20%的表淺性膀胱癌會進(jìn)展為浸潤性膀胱癌。一旦發(fā)展為肌層浸潤性膀胱癌，患者生存時間會大大縮短，5年生存率低于50%。由于其復(fù)發(fā)率高，治療時間長，成為花費最 高的腫瘤之一。2010年美國膀胱癌花費40億美元，估計2020年會達(dá)50億美元。雖然轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者采用以吉西他濱+順鉑為一線的全身化療應(yīng)用越來越廣泛，但是化療后患者平均生存期僅為15個月，5年生存率僅為5%～20%。根據(jù)流行病學(xué)及監(jiān)測數(shù)據(jù)，在過去的30年中膀胱癌患者的病死率未明顯下降[1]。因此，需研發(fā)針對膀胱腫瘤的新的治療藥物。膀胱腫瘤發(fā)病涉及較多信號通路，其中成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)起著非常重要的作用。FGFR1基因擴(kuò)增見于3%的膀胱腫瘤[2]，F(xiàn)GFR3基因擴(kuò)增見于42%的膀胱腫瘤[3]，F(xiàn)GFR3突變見于15～50%的 膀胱腫瘤[3,4]。膀胱腫瘤中未見FGFR2和FGFR4基因擴(kuò)增或突變[5]。以上數(shù)據(jù)說明，與FGFR家族其他成員比較，F(xiàn)GFR3在膀胱腫瘤發(fā)病中的作用更重要，是膀胱腫瘤治療中的一個非常重要的靶點。本文就FGFR3在膀胱癌發(fā)病機(jī)制中的作用、目前靶向FGFR3治療膀胱癌的應(yīng)用作一綜述。

1 FGFR3在膀胱癌發(fā)生中的作用研究

FGFR3是跨膜蛋白，屬于FGFR家族成員之一，是Ⅰ型酪氨酸激酶受體。FGFR3基因位于4號染色體的p16.3上，有19個外顯子。FGFR包含細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和位于胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。FGFR3通過選擇性剪接形成的2個同源異構(gòu)體FGFR3b和FGFR3c，分別表達(dá)于上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)成纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)同2個FGFR3細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合時，會調(diào)動2個FGFR3互相靠攏，導(dǎo)致FGFR3細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶羧基末端互相磷酸化，激活下游蛋白(PLCγ、STATs、AKT、MAPK)，從而將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞生長，血管形成。對接蛋白成纖維細(xì)胞受體底物2α(FRS2α)含有許多不同的磷酸化位點，在FGFR3激活過程中起重要作用。但如果FGFR3過度活躍，易導(dǎo)致腫瘤形成。有以下幾種情況會導(dǎo)致FGFR3過度活躍。

1.1 FGFR3突變 FGFR3發(fā)生突變，自發(fā)形成二硫鍵，導(dǎo)致FGFR3持續(xù)性激活。FGFR3突變存在于75%的低級別非肌層浸潤性膀胱乳頭狀癌及20%的肌層浸潤性膀胱癌[6, 7]。最常見的突變是S249C，位于外顯子7，導(dǎo)致249密碼子半胱氨酸殘基替代絲氨酸殘基，多見于乳頭狀非肌層浸潤性膀胱癌。突變導(dǎo)致二硫鍵形成，使受體二聚化，從而持續(xù)激活FGFR3[4]。R248C是FGFR3另外一種常見的突變，會導(dǎo)致FGFR3細(xì)胞外構(gòu)象出現(xiàn)類似改變，從而激活FGFR3[4]。進(jìn)展期尿路上皮癌組織中FGFR3突變的頻率反而下降[7～9]。Ta期非肌層浸潤性膀胱癌FGFR3突變頻率為84%，T1期為21%，但肌層浸潤性膀胱癌FGFR3突變頻率則<15%[7,8]。Rebouissou等[10]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生FGFR3突變的肌層浸潤性膀胱癌患者通常伴有CDKN2A純合性缺失。FGFR3突變常和預(yù)后相關(guān)[8,11]。而且在膀胱癌發(fā)病通路中最常見的2種情況為FGFR3突變或TP53突變[6]。

1.2 FGFR3基因易位和重組 有研究發(fā)現(xiàn)，除FGFR3突變外，F(xiàn)GFR3基因易位和重組也是FGFR3激活的機(jī)制[12～14]，F(xiàn)GFR3基因易位和基因重組導(dǎo)致FGFR3融合蛋白的形成。研究較多的是FGFR3與卷曲螺旋的酸性轉(zhuǎn)化蛋白(TACC3)組成融合蛋白。多項研究證實，F(xiàn)GFR3-TACC3融合蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌、膀胱癌、口腔癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、膽囊癌與宮頸癌發(fā)病中起重要作用[14～16]。正常情況下TACC3是FGFR3的上游基因。TACC3是TACC家族的成員之一。TACC家族蛋白對有絲分裂過程中的微管組織起關(guān)鍵作用。TACC家族有一個特別重要的結(jié)構(gòu)域即C-末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(TACC域)，是一個高度保守域，有絲分裂期間此域在蛋白質(zhì)定位中起重要作用[17]。TACC3與著絲點纖維及有絲分裂紡錘體的穩(wěn)定起至關(guān)重要的作用。當(dāng)4p16.3中TACC3和FGFR3兩個基因反轉(zhuǎn)，形成70 kb的串聯(lián)重復(fù)，導(dǎo)致FGFR3-TACC3融合蛋白的形成[18]。由于FGFR3-TACC3融合是FGFR3酪氨酸殘基磷酸化激活的關(guān)鍵因素之一，后者會導(dǎo)致MAPK信號通路的激活[14]。

1.3 FGFR3過度表達(dá) 50%的肌層浸潤性膀胱癌組織存在FGFR3過度表達(dá)[3,19]。Gomez-Roman等[20]對22例不同分期的膀胱尿路上皮癌組織中FGFR3突變和過表達(dá)情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤性膀胱組織比較，在pTa、pT1期膀胱腫瘤組織中FGFR3 mRNA過表達(dá)超過8倍，在pT2期FGFR3 mRNA過表達(dá)超過4倍，并且Western blotting和免疫組化法也進(jìn)一步證實該結(jié)果。以上說明膀胱癌常存在FGFR3過表達(dá)。

2 FGFR3在膀胱癌靶向治療中的作用研究

2.1 基因轉(zhuǎn)染研究 基因轉(zhuǎn)染研究證實，F(xiàn)GFR3在尿路上皮腫瘤細(xì)胞增殖中扮演重要角色，同時證實S249C和Y375C等特異突變對膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有重要作用。1999年Cappellen等[4]第一次發(fā)現(xiàn)FGFR3基因具有致癌作用，尤其在膀胱癌中作用最為明顯。同正常尿路上皮標(biāo)本相比，膀胱癌組織標(biāo)本突變的FGFR3 mRNA水平更高，而且最常見的突變是S249C[4]。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)所建立的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH-3T3細(xì)胞)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染突變型FGFR3b-S249C，細(xì)胞增殖速度加快并失去接觸抑制，能導(dǎo)致裸鼠成瘤；用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)也證實FGFR3-Y375C突變會導(dǎo)致FGFR3激活，但是轉(zhuǎn)染野生型的FGFR3b不會導(dǎo)致裸鼠成瘤[21]。Tomlinsonet等[22]對97-7尿路上皮癌細(xì)胞株用shRNA基因沉默或再次表達(dá)S249C FGFR3會抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞的腫瘤特性。Qing等[23]對野生型的FGFR3或突變型的FGFR3用siRNA敲低基因后，會降低細(xì)胞的增殖速度，導(dǎo)致S期和G2期細(xì)胞數(shù)目減少，G1期細(xì)胞增多，而凋亡指數(shù)是穩(wěn)定的，顯示出抑制細(xì)胞的效應(yīng)，體內(nèi)實驗證實siRNA敲低FGFR3基因能抑制裸鼠RT112腫瘤的生長。以上說明FGFR3參與了膀胱癌發(fā)病過程。

2.2 中和性抗體 許多研究已嘗試通過中和抗體靶向FGFR3[9,20,23～25]。Martinez-Torrecuadrada等[25]合成的人單鏈Fv抗體片段能識別膀胱癌RT112細(xì)胞株上的野生型及S249C突變型FGFR3，以劑量依賴的方式抑制RT112細(xì)胞增殖。其機(jī)制可能是阻斷FGF-FGFR3的相互作用。Gomez-Roman等[20]也得出類似的結(jié)果。Qing等[23]研發(fā)的特異的FGFR3單克隆抗體(R3mAb)不僅能夠抑制配體結(jié)合作用，還能夠抑制野生型及各種突變型的FGFR3的二聚化，從而抑制膀胱癌RT112和RT4細(xì)胞株的增殖，抑制FGFR3及p42/44 MAPK的磷酸化。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，5、50 mg/kg的R3mAb均能夠抑制裸鼠FGFR3野生型RT112腫瘤生長，抑制率分別為41%、73%。R3mAb也能抑制裸鼠移植FGFR3突變型膀胱瘤的生長，而且R3mAb對裸鼠無明顯的不良作用[23]。Gust等[9]研究發(fā)現(xiàn)，R3mAb可以抑制膀胱癌UM-UC1細(xì)胞株(高表達(dá)野生型FGFR3)和UM-UC14細(xì)胞株(FGFR3帶有S249C突變)FGFR3磷酸化，可明顯抑制細(xì)胞增殖，具有劑量依賴性；但用R3mAb處理高表達(dá)野生型FGFR3的RT4V6和RT112細(xì)胞株，其抑制作用不顯著。腹腔注射R3mAb(30 mg/kg)能抑制UM-UC14、UM-UC1、RT112移植瘤生長，抑制腫瘤生長的機(jī)制在于抑制細(xì)胞增殖(Ki67指數(shù)下降)，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(裂解的Caspase-3表達(dá)無改變)[9]。

2.3 免疫毒蛋白 Martinez-Torrecuadrada等[26]將FGFR3特異性的Fv片段(3C)與重組白樹毒素NH(2)端融合，大腸埃希菌產(chǎn)生的可溶性免疫毒蛋白能誘導(dǎo)FGFR3移位至核膜，從而導(dǎo)致RT112細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實驗顯示能將免疫缺陷小鼠的腫瘤體積縮小55%～70%，其作用機(jī)制可能為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤縮小。

2.4 酪氨酸激酶抑制劑 目前研發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑包括Dovitinib (TKI258/CHIR258)、BGJ398、AZD4547、PD173074和BMS-582664，均為小分子FGFR3及VEGFR2抑制劑。Lamont等[27]使用PD173074、TKI258和SUS5402小分子抑制劑在納摩爾濃度水平(IC50)就能導(dǎo)致高表達(dá)FGFR3(不論FGFR3是否存在突變型)，但是Ras無突變(Ras無激活)的膀胱癌細(xì)胞株出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與抑制MAPK信號通路有關(guān)。但正常尿路上皮細(xì)胞及Ras突變(Ras激活)的膀胱癌細(xì)胞株不會受PD173074、TKI258和SUS5402小分子抑制劑的影響。裸鼠體內(nèi)實驗顯示上述小分子抑制劑能推遲腫瘤生長，沒有明顯的毒性作用。免疫組化結(jié)果顯示該小分子抑制劑抑制腫瘤生長的機(jī)制為抑制細(xì)胞增殖，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Guagnano等[28]用BCJ398酪氨酸激酶抑制劑也能抑制裸鼠RT112細(xì)胞株移植瘤的生長。Hanze等[29]用Dovitinib處理10個不同的膀胱癌細(xì)胞株，并檢測上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)和神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IC50同細(xì)胞株上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型的狀態(tài)相關(guān)，因此E-cadherin、N-cadherin可預(yù)測膀胱癌細(xì)胞株對Dovitinib治療的反應(yīng)。但Miyake等[30]用PD173074處理不同的尿路上皮癌細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD173074只對FGFR3突變型的細(xì)胞株有效，可致其凋亡。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實，PD173074能抑制裸鼠UM-UC14和MGHU3細(xì)胞株移植瘤(FGFR3突變型)的生長，其機(jī)制在于PD173074能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

FGFR3激活性突變見于75%的非肌層浸潤性膀胱癌，F(xiàn)GFR3過表達(dá)見于50%的肌層浸潤性高級別膀胱癌。敲除突變的FGFR3基因可以抑制膀胱癌細(xì)胞株的增殖、集落形成和浸潤能力，體內(nèi)實驗結(jié)果也證實突變型FGFR3是癌基因。單克隆抗體靶向野生型和突變型FGFR3能抑制膀胱癌細(xì)胞株和移植瘤的生長，部分酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)入了臨床試驗階段。將來FGFR3靶向藥物可用于膀胱癌的治療。