張利超，盧忠勝，張強(qiáng)

(1青海大學(xué)研究生院，西寧810000；2青海省人民醫(yī)院)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤[1，2]。近年來，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率逐年遞增，尤其膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病率最高，約為3.20/10萬(wàn)[3]。目前，臨床治療多采取手術(shù)、術(shù)后放化療等。但由于膠質(zhì)瘤具有浸潤(rùn)性，術(shù)中難以全切，且放化療效果亦不理想[4]，術(shù)后復(fù)發(fā)率高、生存期短[5]。因此，研究膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲機(jī)制至關(guān)重要。microRNA的異常表達(dá)與多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a能使膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲受到顯著抑制，miR-29a通過靶向DNMT3A/3B來抑制膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移[7～10]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sp1的異常表達(dá)與肝癌、胃癌等密切相關(guān)。Sp1在膠質(zhì)瘤組織中過表達(dá)，通過調(diào)控基因MMP-2來促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲[11]?；谀z質(zhì)瘤中miR-29a低表達(dá)和Sp1高表達(dá)，兩者是否存在某種機(jī)制來調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展尚未見相關(guān)研究。2017年1～12月，本研究對(duì)miR-29a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的抑制作用及機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞株OLN93，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、A172、U251、SHG44，均由上海中科院細(xì)胞所提供。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；DMSO購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自Fermentas；胎牛血清、胰酶購(gòu)自HyClone；蛋白酶/磷酸酶抑制劑購(gòu)自Sigma公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR購(gòu)自Invitrogen公司；Tris、硼酸、瓊脂糖、蛋白上樣緩沖液(5×)、Tween-20、Acr/Bis(29∶1)、Glycine、SDS、10% SDS、引物、TEMED、DTT、EDTA、瓊脂粉、濃鹽酸、乙醇、異丙醇、甲醇購(gòu)自上海生工科技有限公司；氯化鈉、氯化鉀、Na2HPO4、KH2PO4購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；microRNA mimics、microRNA NC購(gòu)自蘇州吉瑪公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay購(gòu)自美國(guó)Promega公司；psiCHECKTM-2購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司；抗Sp1兔多克隆抗體購(gòu)自Abcam；抗β-actin鼠單克隆抗體、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自北京康為生物有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自Tiangen公司；酶Xhol Ⅰ和Not Ⅰ、T4 DNA連接酶購(gòu)自MBI Fermentas；Transwell小室、Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞均用含10% FBS和0.1%雙抗的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并保持適當(dāng)濕度。定時(shí)查看細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用胰酶消化并傳代。

1.3 細(xì)胞中Sp1 mRNA及miR-29a表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。細(xì)胞中RNA按六孔板試劑盒法進(jìn)行操作；使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成；PCR過程按Invitrogen的SYBR實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書在Real-Time PCR儀上進(jìn)。用2-ΔΔCt法(Ct為循環(huán)閾值)計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。合成cDNA第一鏈所用的引物序列，miR-29a ：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAACCGAT-3′，U6 ：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCACGAATTTGCGT-GTCAT-3′。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR premix 10 μL，microRNA上游引物(2.5 μmol/L)0.5 μL，microRNA下游引物(2.5 μmol/L)0.5 μL，cDNA 1 μL，無菌水8 μL。實(shí)時(shí)定量PCR所用引物序列，U6 上游引物：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′、下游引物：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′；miR-29a 上游引物：5′-CCGTCCTCCGTAGCACCATCTGAAAT-3′、下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；Sp1 上游引物：5′-CCTCCAGACCATTAACCTCAG-3′、下游引物：5′-TCCACCTGCTGTGTCATCAT-3′；β-actin 上游引物：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′、下游引物：AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.4 細(xì)胞中Sp1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞去掉培養(yǎng)基后加入蛋白裂解液，行蛋白定量后用于上樣跑膠或者-80 ℃保存?zhèn)溆?。恒壓電泳，濃縮膠70 V，30 min；分離膠110 V電泳，電泳時(shí)間依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行選擇；調(diào)節(jié)恒流300 mA轉(zhuǎn)膜2～3 h；室溫封閉1～2 h；一抗4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育2～3 h；用ECL Solution在暗室中X線片顯影，依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱調(diào)整曝光的時(shí)間長(zhǎng)短，曝光后，洗片機(jī)沖洗膠片，取膠片放入X線片自動(dòng)洗片機(jī)中顯影。將顯影好的內(nèi)參與目的基因的膠片在掃描儀上掃描并記錄。目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和A172作為研究對(duì)象，用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取部分U87、A172細(xì)胞，均隨機(jī)分為miR-29a過表達(dá)組、陰性對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染外源性miR-29a mimics、miR-NC mimics。分別用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Sp1 mRNA、蛋白表達(dá)，方法同1.3、1.4。另取部分U87、A172細(xì)胞，均隨機(jī)分為si-Sp1-1組、si-Sp1-2組、陰性對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染si-Sp1-1、si-Sp1-2、si-NC。

1.6 miR-29a對(duì)Sp1的直接靶向作用檢測(cè) 用TargetScanHuman v7.0軟件確定了miR-29a與Sp1的結(jié)合位點(diǎn)，將Sp1的3′-UTR區(qū)(包含與miR-29a的結(jié)合序列)克隆到psiCHECK-2質(zhì)粒載體上，由蘇州金唯智生物公司合成。直接合成Sp1 3′-UTR區(qū)并連接到psiCHECK-2質(zhì)粒載體上，將野生型/突變型質(zhì)粒載體分別與miR-29a/NC共轉(zhuǎn)染至U87、A172細(xì)胞中。雙熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將存放于-80 ℃的Matrigel基質(zhì)膠轉(zhuǎn)移至冰盒內(nèi)放置4 ℃過夜；冰上包被基底膜置于37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～5 h；水化基底膜置于培養(yǎng)箱內(nèi)30 min。用含1% FBS的DMEM重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為5×105/mL；向準(zhǔn)備好的上室內(nèi)加入混勻的細(xì)胞懸液200 μL，下室內(nèi)加含20% FBS的DMEM 600 μL，置于培養(yǎng)箱中24 h。觀察細(xì)胞染色并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 OLN93細(xì)胞及U87、A172、U251、SHG44細(xì)胞中Sp1表達(dá)比較 OLN93細(xì)胞及U87、A172、U251、SHG44細(xì)胞中Sp1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.001 40±0.000 053、 0.018 16±0.000 183、0.035 04±0.001 251、0.030 54±0.000 307、0.011 81±0.000 072，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.087 7±0.003 32、0.430 2±0.018 6、 0.870 5±0.031 3、0.736 4±0.024 9、 0.510 7±0.011 9，U87、A172、U251、SHG44細(xì)胞中Sp1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于OLN93細(xì)胞(P均<0.05)。

2.2 OLN93細(xì)胞及U87、A172、U251、SHG44細(xì)胞中miR-29a表達(dá)比較 OLN93細(xì)胞及U87、A172、U251、SHG44細(xì)胞中miR-29a相對(duì)表達(dá)量分別為0.000 134 5±0.000 022 44、0.000 022 9±0.000 000 83、0.000 004 0±0.000 000 34、 0.000 009 0±0.000 000 68、0.000 030 4±0.000 001 78，U87、A172、U251、SHG44細(xì)胞中miR-29a相對(duì)表達(dá)量均低于OLN93細(xì)胞(P均<0.05)。

2.3 miR-29a過表達(dá)對(duì)U87、A172細(xì)胞中Sp1表達(dá)的影響 U87細(xì)胞miR-29a過表達(dá)組、陰性對(duì)照組中Sp1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.000 466 0±0.000 026 67、0.000 838 6±0.000 027 23，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.439 8±0.018 63、0.908 3±0.024 17；A172細(xì)胞miR-29a過表達(dá)組、陰性對(duì)照組中Sp1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.001 565±0.000 093 24、0.003 171±0.000 097 03，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.488 5±0.019 1、0.918 4±0.016 52。U87、A172細(xì)胞miR-29a過表達(dá)組中Sp1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量均較陰性對(duì)照組低(P均<0.05)。

2.4 miR-29a對(duì)Sp1的直接靶向作用 雙熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在U87和A172細(xì)胞中miR-29a能明顯抑制野生型載體的熒光強(qiáng)度，且突變型載體上的熒光強(qiáng)度無變化。miR-29a能直接作用于Sp1 3′-UTR區(qū)，并能下調(diào)Sp1的表達(dá)。

2.5 miR-29a過表達(dá)對(duì)U87、A172細(xì)胞遷移的影響 U87細(xì)胞miR-29a過表達(dá)組、陰性對(duì)照組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為(506±19)、(125 5±103)個(gè)/視野；A172細(xì)胞miR-29a過表達(dá)組、陰性對(duì)照組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為(483±21)、(1 317±23)個(gè)/視野；U87、A172細(xì)胞miR-29a過表達(dá)組中遷移細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組少(P均<0.05)。

2.6 Sp1基因沉默后對(duì)U87、A172細(xì)胞遷移的影響 U87細(xì)胞si-Sp1-1組、si-Sp1-2組、陰性對(duì)照組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為(268±8)、(249±10)、(653±16)個(gè)/視野；A172細(xì)胞si-Sp1-1組、si-Sp1-2組、陰性對(duì)照組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為(648±17)、(680±32)、(1 883±23)個(gè)/視野；U87、A172細(xì)胞si-Sp1-1組、si-Sp1-2組中遷移細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組少(P均<0.05)。

3 討論

研究表明，miRNA在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，可通過影響細(xì)胞的多種基因，進(jìn)而參與腫瘤的生物學(xué)功能，同時(shí)異常表達(dá)的miRNA與膠質(zhì)瘤的關(guān)系密切[12,13]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，在神經(jīng)導(dǎo)航、術(shù)中MRI、功能定位、電生理監(jiān)測(cè)以及實(shí)時(shí)熒光等現(xiàn)代技術(shù)的支持下，可實(shí)現(xiàn)手術(shù)精準(zhǔn)切除，術(shù)后再行化放療的綜合臨床治療，但該類患者的預(yù)后仍然很差。膠質(zhì)瘤的治療已成為神經(jīng)外科臨床工作中的一項(xiàng)難題，膠質(zhì)瘤分子機(jī)制的探討有可能為膠質(zhì)瘤的診療提供一種新的方法。

研究表明Sp1與腫瘤的諸多生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)，并發(fā)揮重要作用，比如腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞的血管再生等[14，15]。Sp1的異常表達(dá)有可能導(dǎo)致人類某些疾病的發(fā)生。研究表明，在肝癌、胃癌等腫瘤組織中Sp1高表達(dá)[16，17]，在本研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Sp1也呈高表達(dá)。在干擾Sp1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖可受到抑制[14]，但Sp1的異常表達(dá)能否也對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲產(chǎn)生作用目前尚不清楚。本研究結(jié)果表明，干擾Sp1表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力受到明顯抑制。

本研究對(duì)miRNA調(diào)節(jié)Sp1發(fā)揮調(diào)控作用進(jìn)行探討。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方面起重要作用，且通過預(yù)測(cè)軟件顯示在Sp1的3′-UTR區(qū)存在miR-29a的特定結(jié)合位點(diǎn)；同時(shí)細(xì)胞依賴的生化分析也進(jìn)一步證實(shí)。本研究首次提出并驗(yàn)證了在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-29a能用直接結(jié)合的方式來抑制Sp1的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中miR-29a后過表達(dá)，Sp1的表達(dá)下降。通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-29a可直接靶向Sp1 3′-UTR區(qū)來抑制基因的表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)miR-29a過表達(dá)能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，這種現(xiàn)象與干擾Sp1后細(xì)胞遷移受到抑制相符。即miR-29a在細(xì)胞內(nèi)模擬了Sp1干擾后的效果，進(jìn)而表明miR-29a可通過下調(diào)Sp1的表達(dá)來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。事實(shí)上，miR-29a也可靶向基因DNMT3A/3B使膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移受到抑制[18]。原因可能為1個(gè)miRNA能調(diào)控不同的靶基因[19～21]。同樣在其他腫瘤細(xì)胞中也出現(xiàn)類似情況。在胃癌組織中miR-29a可直接靶向調(diào)節(jié)基因p42.3、Robo1、VEGF-A等[9,18,19]，通過阻斷迂回指導(dǎo)受體1[20]，上調(diào)miR-29a的表達(dá)來降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力。另外，miR-29抑制胃癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制為下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK4和CDK6的表達(dá)[21]。在前列腺癌中，通過直接靶向組蛋白賴氨酸脫甲基酶5B，上調(diào)miR-29a的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[22]。在腎細(xì)胞癌組織中miR-29a表達(dá)下降，并通過靶向賴氨酸氧化酶同系物2抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲[23]。Tréhoux等[24]證明，在胰腺癌組織中，miR-29a通過直接靶向黏蛋白1抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并使細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感。在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-29a負(fù)性調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]。在非小細(xì)胞肺癌組織中miR-29a表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)與腫瘤TNM分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。另外，抑制miR-29a表達(dá)抑制了非小細(xì)胞肺癌遷移和侵襲[26]。然而，在結(jié)直腸癌組織中miR-29a通過靶向Krüppel樣因子4來促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，從而調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2和上皮鈣黏蛋白的表達(dá)[27]。以上研究結(jié)果表明，miR-29a對(duì)腫瘤的作用是可變的，并且表現(xiàn)出組織特異性。miR-29a可能在以上類型腫瘤中起重要作用，并且可能是潛在的治療靶基因。miR-29a低表達(dá)提示腫瘤患者預(yù)后不良，并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中包括膠質(zhì)瘤[7,9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-29a表達(dá)下調(diào)。本研究證實(shí)Sp1參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，且Sp1的表達(dá)至少部分受miR-29a的調(diào)控。然而，并未發(fā)現(xiàn)Sp1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移下游的作用機(jī)制。過表達(dá)miR-29a或干擾Sp1后均能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，這有可能為今后治療膠質(zhì)瘤提供新的方向。

綜上所述，Sp1在生物體內(nèi)有可能作為促癌因子發(fā)揮作用，Sp1的異常表達(dá)使腫瘤細(xì)胞的惡化程度進(jìn)一步增強(qiáng)；miR-29a在生物體內(nèi)扮演著抑癌因子的角色，其高表達(dá)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞遷移，進(jìn)而發(fā)揮著抑癌的重要作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)基因參與的復(fù)雜程序化過程，不是單個(gè)基因或單個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制所決定的。本研究證明Sp1至少部分受miR-29a的調(diào)控，且在干擾Sp1及miR-29a表達(dá)后，均能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為。這有可能為膠質(zhì)瘤的診療提供了靶向位點(diǎn)及新的思路。