楊其彬，何泳龍，青玉鳳，李玲琴，謝文光，周京國

(1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000；2成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

自噬是真核生物普遍存在的自穩(wěn)機(jī)制，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞自我保護(hù)和生存等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，自噬途徑及其蛋白在免疫和炎癥中有重要作用，細(xì)胞自噬的缺陷或自噬相關(guān)蛋白的變異與炎癥性疾病的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)[1,2]。近年來，痛風(fēng)患病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)[3]，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽晶體(MSU)刺激核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)炎性體活化伴隨自噬活性增加[4]；自噬又可通過直接或間接作用負(fù)調(diào)控炎性體，限制炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的產(chǎn)生。提示自噬在控制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因(ATG)6的同系物，是第1個(gè)確定的哺乳動(dòng)物自噬基因產(chǎn)物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，其編碼的Beclin-1蛋白通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其他ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，調(diào)節(jié)自噬活性[5]。Beclin-1參與自噬早期過程，促進(jìn)自噬小泡的成核和從細(xì)胞溶質(zhì)招募蛋白質(zhì)。Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，說明Beclin-1是自噬的調(diào)控基因[6]。目前尚無痛風(fēng)患者的自噬研究。本文觀察間歇期痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(IGA)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)變化，并通過自噬功能干預(yù)，探討自噬在IGA炎癥過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013年9月～2014年5月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕血液科收治的間歇期IGA患者(IGA組)40例，均為男性，年齡24～67(44±12)歲，病程(11±6)年；IGA納入標(biāo)準(zhǔn)為急性發(fā)作期[9]后至少2周，血沉、CRP炎癥指標(biāo)正常，排除有痛風(fēng)石形成、尿酸鹽腎病及尿酸性尿路結(jié)石的患者。同期選擇體檢健康男性80例作為正常對(duì)照組，年齡23～65(46±11)歲，均無痛風(fēng)家族史、心腦血管病史、感染等炎癥疾病，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢查無異常。IGA患者與對(duì)照者年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均知情同意。

1.2 單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離及培養(yǎng) 取IGA患者及健康對(duì)照者外周靜脈血3 mL，肝素鈉抗凝。用人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?無菌分離外周血PBMC。

1.3 PBMC中Beclin-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。用TRIzol試劑(Invitrogen公司)，依據(jù)說明書提取PBMC總RNA，加入無RNA酶水30 μL溶解RNA。取RNA樣品5 μL電泳，在1.0%瓊脂糖凝膠圖譜中顯示三條帶。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA在波長260、280 nm處吸光度(A)值，并計(jì)算A260/A280(1.8～2.0者采用)。cDNA的合成按逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作，條件為42 ℃ 45 min終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄體系60 μL：RNase Free H2O 24 μL、5×RT Buffer 12 μL、dNTP Mixture 6 μL、Super-RI 1.5 μL、RT-Enhancer 1.5 μL、Random Primer 3 μL、總RNA 9 μL、ReverTra Ace 3 μL。產(chǎn)物cDNA凍存于-20 ℃?zhèn)溆?。將cDNA于熒光定量PCR儀上檢測(cè)，建立總體積為25 μL的反應(yīng)體系：Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，USA)12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本均作復(fù)孔，復(fù)孔間的Ct值差異控制在0.5以內(nèi)。擴(kuò)增均在ABI 7900 Real-Time PCR儀(ABI公司，USA)上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線。以目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值為△Ct，用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，beclin-1上游引物5′-CCGCAAGATAGTGGCAGAA-3′，下游引物5′-CGACCCAGCCTGAAGTTAT-3′，產(chǎn)物長度264 bp；β-actin上游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG -3′，下游引物5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG -3′，產(chǎn)物長度128 bp。

1.4 PBMC中Beclin-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting技術(shù)。用細(xì)胞裂解液(RIRA)提取PBMC總蛋白，行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜及封閉，一抗分別為兔抗人Beclin-1(1∶1 000，CST公司)、GAPDH(1∶1 000，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，二抗為山羊抗兔IgG(1∶3 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行孵育，TBST洗膜，ECL顯色，曝光后掃描，使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，Beclin-1灰度值/GAPDH灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 自噬功能干預(yù) 隨機(jī)抽取5例IGA患者外周靜脈血20 mL，肝素鈉抗凝，5 mL/組，分為四組，分別為未刺激組及MSU刺激1、3、6 h組，MSU刺激組加入MSU(終濃度100 g/mL)后置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育不同時(shí)間后提取PBMC。隨機(jī)抽取5例IGA患者及5例體檢健康者外周靜脈血20 mL，均隨機(jī)分為五組，分別為空白對(duì)照組、雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組、巴佛洛霉素A1組、E64d+pepstatin A組?？瞻讓?duì)照組不做干預(yù)，其他各組均加入MSU干預(yù)(MSU終濃度100 g/mL)，同時(shí)雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組、巴佛洛霉素A1組、E64d+pepstatin A組分別加入自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(終濃度為25 nmol/L)、抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度為5 mmol/L)、巴佛洛霉素A1(終濃度為10 mol/L)、溶酶體蛋白酶抑制劑(E64d+pepstatin A，終濃度均為10 nmol/L)進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)后靜脈血在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后分離血漿并提取PBMC。用Western blotting技術(shù)檢測(cè)PBMC中Beclin-1蛋白表達(dá)，方法同1.4。

1.6 血漿IL-1β水平檢測(cè) 取1.5中上述IGA患者自噬激動(dòng)/抑制功能干預(yù)實(shí)驗(yàn)分離的血漿樣本，按照IL-1β試劑(欣博盛)使用說明用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血漿IL-1β水平。

2 結(jié)果

2.1 IGA組與正常對(duì)照組PBMC中Beclin-1 mRNA表達(dá)比較 IGA組、正常對(duì)照組PBMC中Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.000 16(0.000 43)、0.000 56(0.000 77)。與正常對(duì)照組比較，IGA組Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低(P<0.05)。

2.2 IGA組與正常對(duì)照組PBMC中Beclin-1蛋白表達(dá)比較 IGA組、正常對(duì)照組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.54±0.45、1.84±0.68。與正常對(duì)照組比較， IGA組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低(P<0.05)。

2.3 MSU對(duì)IGA患者PBMC中Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 未刺激組及MSU刺激1、3、6 h組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.11±0.37、4.91±2.49、5.94±2.74、0.06±0.02。MSU刺激1、3 h組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較未刺激組高(P均<0.05)，而MSU刺激6 h組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較未刺激組低(P<0.05)。

2.4 MSU聯(lián)合自噬激動(dòng)劑/抑制劑對(duì)PBMC中Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 IGA患者：空白對(duì)照組、雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組、巴佛洛霉素A1組、E64d+pepstatin A組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.13±0.25、0.37±0.05、1.65±0.64、0.98±0.27、2.18±0.26。雷帕霉素組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組低(P<0.01)；自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤、巴佛洛霉素A1、E64d+pepstatin A)組較雷帕霉素組高(P均<0.05)，且自噬抑制劑組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)至空白對(duì)照組水平(P均<0.05)，自噬溶酶體抑制劑(E64d+pepA)組的Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量最高(P<0.05)。體檢健康者：空白對(duì)照組、MSU組、雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組、巴佛洛霉素A1組、E64d+pepstatin A組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.72±0.06、1.76±0.06、1.72±0.04、0.62±0.04、0.53±0.06、0.88±0.19?？瞻讓?duì)照組、MSU組、雷帕霉素組PBMC中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而自噬抑制劑組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較其他組低(P均<0.05)。

2.5 MSU聯(lián)合自噬激動(dòng)劑/抑制劑對(duì)IGA患者血漿IL-1β水平的影響 空白對(duì)照組、MSU組、雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組、巴佛洛霉素A1組、E64d+pepstatin A組血漿IL-1β水平分別為(12.50±8.75)、(12 125±2 740)、(19 317±1 594)、(33 855±8 858)、(34 056±5 110)、(33 021±3 879)pg/mL。血漿IL-1β水平比較，MSU、雷帕霉素組較空白對(duì)照組高(P均<0.05)，雷帕霉素組較MSU組低(P<0.05)，自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤、巴佛洛霉素A1和E64d+pepstatin A)組較空白對(duì)照組、MSU組高(P均<0.05)，自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤組、巴佛洛霉素A1組和E64d+pepstatin A組)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

自噬是參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器降解的一種高度保守的生理行為，通過雙層膜結(jié)構(gòu)包裹待降解物質(zhì)形成自噬體，轉(zhuǎn)運(yùn)其至溶酶體并與之結(jié)合形成自噬溶酶體而降解，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[10]。到目前為止，已知自噬的作用過程包括：①由雙層膜結(jié)構(gòu)始發(fā)；②雙層膜結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張延伸；③分化成熟成為自噬小體；④與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體；⑤包裹攝入物質(zhì)的降解[11]。痛風(fēng)是典型的炎癥性疾病，但目前有關(guān)自噬在痛風(fēng)中的作用研究尚少。體外研究發(fā)現(xiàn)，MSU刺激NLRP3炎性體活化伴隨自噬活性增加。自噬又可通過直接或間接作用負(fù)調(diào)控NLRP3炎性體限制炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生[4]。結(jié)合痛風(fēng)炎癥具有自我緩解的臨床特點(diǎn)，提示自噬在痛風(fēng)炎癥反應(yīng)過程中可能具有重要意義。

Beclin-1是自噬的特異性基因。本研究檢測(cè)IGA患者PBMC中Beclin-1基因和蛋白表達(dá)變化，初步探討自噬在痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的作用。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，IGA組Beclin-1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量低，提示痛風(fēng)患者存在自噬異常，自噬可能參與了痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展。先前的研究[12]結(jié)果顯示，Beclin-1蛋白表達(dá)變化可反映自噬活性。

饑餓是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的經(jīng)典方法之一。研究證實(shí)饑餓可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，自噬進(jìn)程十分快速，Beclin-1在饑餓誘導(dǎo)后1 h表達(dá)上調(diào)，3 h達(dá)峰值后逐漸下降[12]。本研究結(jié)果顯示，MSU刺激IGA患者1、3 h后PBMC中Beclin-1蛋白表達(dá)升高，而刺激6 h后Beclin-1蛋白表達(dá)下降至刺激前水平，該結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。體外研究表明，使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素增強(qiáng)自噬后炎癥因子IL-1β水平降低，且Beclin-1通過泛素化方式被自噬溶酶體降解[4]。Beclin-1表達(dá)降低提示痛風(fēng)患者存在自噬異常激活，且可能通過自噬溶酶體途徑進(jìn)行降解。為證實(shí)這一假設(shè)，本研究阻斷自噬通路發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素組Beclin-1蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組低，而自噬抑制劑組Beclin-1蛋白表達(dá)較雷帕霉素組高，且阻斷自噬溶酶體組的Beclin-1蛋白表達(dá)最高，說明Beclin-1進(jìn)入自噬溶酶體通路且被其降解。同時(shí)檢測(cè)了體檢健康者PBMC中Beclin-1蛋白在自噬功能干預(yù)下的表達(dá)，與痛風(fēng)患者的表達(dá)存在明顯差異，進(jìn)一步支持自噬在痛風(fēng)炎癥調(diào)節(jié)過程中可能發(fā)揮重要作用。

IL-1β是介導(dǎo)痛風(fēng)炎癥最重要的效應(yīng)因子。本研究檢測(cè)了血漿IL-1β水平，與MSU組比較，雷帕霉素組血漿IL-1β水平低，而自噬抑制劑組血漿IL-1β水平高。結(jié)果證實(shí)自噬能抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[4,12]，上述結(jié)果提示在MSU激活自噬過程中，Beclin-1參與自噬途徑并最終被自噬溶酶體降解，可見增強(qiáng)自噬能抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者早期自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)異常，通過自噬功能干預(yù)證實(shí)Beclin-1參與痛風(fēng)患者自噬途徑并被自噬溶酶體降解，有助于闡明自噬參與痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的機(jī)制。