劉美，鄧萍萍 ，馬勛泰

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

皮質(zhì)發(fā)育是一個非常復(fù)雜的過程，主要包括神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新、分化、遷移、成熟等步驟，其中涉及許多信號通路的激活。由于發(fā)育信號級聯(lián)過程中的異常則可導(dǎo)致嚴(yán)重的先天性異常，如皮質(zhì)發(fā)育畸形(MCD)。MCD是由于皮質(zhì)發(fā)育過程中某些基因或蛋白發(fā)生突變或異常而引起的，是難治性癲癇的主要病因。MCD是一組疾病，包括局灶性皮質(zhì)發(fā)育障礙、前腦無裂畸形(HPE)、室周異位癥(PH)、小頭畸形(MCPH)、巨腦回畸形、無腦回畸形等。目前人們已發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路、Wnt信號通路、Reelin信號通路，以及最近備受關(guān)注的Sonic hedgehog (Shh)信號通路[1]等多條信號通路與大腦MCD有關(guān)。mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素[2]等已應(yīng)用于動物實驗及臨床，證明其能改善MCD的病理及臨床表現(xiàn)。Shh信號通路與皮質(zhì)發(fā)育障礙密切相關(guān)。Shh基因編碼的Shh蛋白是多種組織器官發(fā)育所必需的，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、四肢和眼睛等[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Shh信號通路與HPE、PH、MCPH、Feingold 綜合征、Jouber綜合征(JS)密切相關(guān)?，F(xiàn)將Shh信號通路在大腦MCD發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 Shh信號通路

果蠅刺猬(hh)基因是1980年在對果蠅發(fā)育研究過程中發(fā)現(xiàn)的一種基因，哺乳動物體內(nèi)有3種hh同系物：Shh、Desert Hedgehog(DHH)、Indian Hedgehog(IHH)[4]，分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。 Shh與腦、脊髄、肺臟、腎臟、毛發(fā)、面部和四肢等多種器官的形態(tài)形成有關(guān)，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[5]。

Shh信號傳導(dǎo)通路由Shh、Patched(Ptc)、Smoothened(Smo)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(Fu)、Fu抑制劑(SuFu)、類運動蛋白 (Cos2)、蛋白激酶A(PKA)及下游的鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成。Ptc由抑癌基因編碼，是由12個跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，是Shh的受體，在沒有配體結(jié)合的情況下，抑制Smo的活性，對Shh信號起負(fù)調(diào)控。 Smo由原癌基因編碼，是一個7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，跨膜區(qū)氨基酸序列高度保守，C 末端的絲氨酸與蘇氨酸殘基為磷酸化部位，蛋白激酶催化時結(jié)合磷酸基團(tuán)，其磷酸化水平改變核轉(zhuǎn)錄因子的活性狀態(tài)[6]。Smo是Hh信號傳遞所必須的受體。在無Hh、Ptc的情況下，激活Smo可導(dǎo) 致Hh 靶基因的活化；基因Smo突變時，可出現(xiàn)與Hh 基因突變相同的表征。其中Ci/Gli、Fu起正調(diào)控作用，Cos 2、PKA起負(fù)調(diào)控作用。Gli蛋白家族成員是較大的多功能的轉(zhuǎn)錄因子，屬于C2 H2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。Gli蛋白是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，脊椎動物中Gli至少由Gli1、Gli2、Gli3 3種成分組成，Gli1、Gli2主要起轉(zhuǎn)錄激活作用，Gli3起轉(zhuǎn)錄抑制作用[7]。

Shh信號通路主要包括胞膜部分、胞質(zhì)和胞核三部分，當(dāng)不存在hedgehog配體時，胞膜上的Shh受體Ptc將抑制Smo的活性，Smo無法將Shh信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)，胞漿內(nèi)Gli與一些蛋白如Fu、cos2、Sufu在微管上結(jié)合形成復(fù)合物，Gli被蛋白酶水解為非活性形式導(dǎo)致其下游的轉(zhuǎn)錄受到抑制。當(dāng)hedgehog與Ptc結(jié)合時，Smo上的抑制效應(yīng)被解除，處于激活狀態(tài)的Smo聚集在初級纖毛上并引起Cos2和Fu過度磷酸化，導(dǎo)致復(fù)合物從微管上解離，Gli的蛋白水解被抑制，其以活性形式進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核以后Ciact與CREB結(jié)合蛋白(CBP)結(jié)合并激活Shh靶基因，以維持胚胎發(fā)育、促進(jìn)自我更新、血管生成等多種生物學(xué)活性[5]。

Shh基因及其信號通路在胚胎的發(fā)生、發(fā)育中起重要作用，涉及許多器官的發(fā)育及成體組織穩(wěn)態(tài)的各個方面。在神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要包括兩個方面，一是對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的誘導(dǎo)作用，二是對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤形成的影響。它介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等重要發(fā)育過程。

2 MCD的發(fā)病機(jī)制

MCD的解剖和組織學(xué)亞型取決于影響大腦正常發(fā)育失敗的時刻及損傷的嚴(yán)重程度或遺傳異常。其發(fā)病機(jī)制主要包括：①遺傳因素，如染色體異常、基因突變等；②物理化學(xué)損傷，包括電離輻射、酒精、飲食等；③感染，包括病毒或細(xì)菌的感染，如巨細(xì)胞病毒、寨卡病毒等；④其他。MCD是一組有著高度臨床表現(xiàn)異質(zhì)性和致殘性的疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩和癲癇的常見原因，尤其是難治性癲癇，據(jù)估計，高達(dá)40%的難治性癲癇患兒有MCD[8]。多數(shù)MCD可通過中等-高分辨MRI檢查進(jìn)行區(qū)分。MRI上的關(guān)鍵特征包括MCD的分布部位及嚴(yán)重程度、皮質(zhì)表面情況、灰白質(zhì)之間的界限、皮質(zhì)厚度及相關(guān)腦部畸形等。

根據(jù)皮質(zhì)發(fā)育的過程可將MCD形分為三大類：Ⅰ組神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)增殖或凋亡有關(guān)的畸形，包括MCPH，巨腦癥等；Ⅱ組神經(jīng)元異常遷移有關(guān)的畸形，如無腦回畸形、鵝卵石樣畸形等；Ⅲ組皮質(zhì)組建異常有關(guān)的畸形，如多小腦回畸形、局灶性皮質(zhì)發(fā)育障礙(FCD)等[9]。其中國際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)在2011年報告了一個三級分類系統(tǒng)，將局灶性皮質(zhì)發(fā)育障礙分為FCDI型：神經(jīng)元遷徙及成熟異常導(dǎo)致的皮層分層異常的皮質(zhì)畸形。FCDII型表現(xiàn)為皮層分層異常和異性神經(jīng)元的皮質(zhì)畸形。FCD Ⅲ型表現(xiàn)為皮層異常伴其他臨近組織病變[10]。

3 Shh在MCD發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

3.1 Shh在HPE發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制 HPE又稱全前腦畸形，是胚胎發(fā)育過程中，前腦發(fā)育障礙引起的一組復(fù)雜的顱腦和面部畸形。HPE是一種遺傳異質(zhì)性疾病，其臨床表現(xiàn)為極為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及顏面畸形，常造成流產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒1 歲內(nèi)死亡，新生兒存活率極低。HPE也可表現(xiàn)為臨床癥狀較輕的腦畸形，導(dǎo)致患兒出現(xiàn)小頭癥、智力低下、癲癇等。HPE的病因尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)。與 HPE 相關(guān)的遺傳致病因素主要有單基因突變、基因組拷貝數(shù)目變異 (CNVs) 及染色體異常[11]。

Shh是最著名的導(dǎo)致HPE的基因，對誘導(dǎo)腹側(cè)神經(jīng)管的發(fā)育具有重要的作用。在Shh(-/-)小鼠模型中小鼠前腦、中腹側(cè)結(jié)構(gòu)不存在，大腦端腦結(jié)構(gòu)無法分開，眼球不分離，形成一系列腦、脊索和顱面異常[12]，模擬了人類HPE的表型。Erich等[13,14]，證實了Shh的單倍體不足在人類中可引起HPE。另外有研究[15]使用Shh信號通路拮抗劑環(huán)巴胺及其有效類似物作用于孕鼠，其子代產(chǎn)生了唇裂、腭裂及HPE相關(guān)表型，環(huán)巴胺主要抑制Smo從而抑制了Shh信號傳導(dǎo)。乙醇、視黃酸等HPE致畸劑由于消除了Shh信號傳導(dǎo)從而產(chǎn)生前腦裂畸形一系列表型[16]。在HPE患者中也發(fā)現(xiàn)存在跨膜蛋白受體PTCH1基因突變[17]。Shh信號通路的下游效應(yīng)因子Gli2的變異同樣可以導(dǎo)致HPE，Gli2-/-可以導(dǎo)致腦部、面部畸形，而Gli2+/-可使實驗動物對致畸因子引起的HPE的敏感性增加[18]。端腦和間腦的分離還取決于Shh與Gli3的相互作用[19]。Shh通過自切割產(chǎn)生N-端和C-端兩個片段，Shh-N的末端共價結(jié)合一個膽固醇分子，有研究[20]在動物模型中給予膽固醇合成的抑制劑，同樣導(dǎo)致了HPE樣畸形。

3.2 Shh在PH發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制 PH是最常見的MCD之一，主要臨床表現(xiàn)為癲癇發(fā)作、智力低下和不同程度的精神運動發(fā)育遲緩，影像學(xué)主要表現(xiàn)為雙側(cè)側(cè)腦室旁對稱的連續(xù)或者不連續(xù)的結(jié)節(jié)狀的異位灰質(zhì)。83%～100%經(jīng)典的家族性PH女性患者與細(xì)絲蛋白A(FLNA)基因突變有關(guān)。除FLNA基因之外，二磷酸腺苷基化因子鳥嘌呤核苷酸交換因子2 (ARFGEF2)基因以及多聚谷氨酰胺結(jié)合蛋白1(PQBP1)基因突變同樣可以引起PH相同的表型。FLNA編碼一種大型微絲結(jié)合磷酸化蛋白，可穩(wěn)定細(xì)胞骨架，有利于腦室上皮局部黏附的正確形成。ARFGEF2基因編碼BIG2，BIG2是蛋白激酶A錨定蛋白(AKAP)，其通過其Sec7結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運和從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運的過程[21]。Big2和FLNA相互作用調(diào)節(jié)整合素/樁蛋白在細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和周轉(zhuǎn)，從而直接影響神經(jīng)遷移。神經(jīng)遷徙的機(jī)制之一為頂端脫離。損失FLNA或BIG2導(dǎo)致沿神經(jīng)外膜各種細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白如鈣黏蛋白和樁蛋白的減弱表達(dá)[22，23]，可使頂端提前脫離，在脫離之前，Shh信號通過初級纖毛維持[24]。這個纖毛在轉(zhuǎn)導(dǎo)Shh信號維持神經(jīng)上皮細(xì)胞在增殖狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]，頂端脫離導(dǎo)致纖毛的解體，纖毛解體使 Shh信號傳導(dǎo)喪失和與祖細(xì)胞離開細(xì)胞周期的增殖下降，從而參與異位結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。低密度脂蛋白相關(guān)蛋白2(LRP2)編碼巨蛋白。巨蛋白已被證明在前腦中螯合Shh，并介導(dǎo)Shh-Ptch內(nèi)吞作用[26]。LRP2突變可影響Shh信號通路的傳導(dǎo)，可解釋LRP2突變患者中觀察到的異常神經(jīng)元定位。

3.3 Shh在MCPH發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制 MCPH又稱原發(fā)性小頭癥，是一組腦發(fā)育的常染色體隱性遺傳性疾病。小腦癥基因(MCPH1)、WD重復(fù)區(qū)域-62(WDR62)、細(xì)胞周期依賴蛋白激酶調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白2基因(CDK5RAP2)、人類中心體蛋白152基因(CEP152)、非正常紡錘體樣蛋白基因(SPM)、著絲粒相關(guān)蛋白基因CENPJ和SCL-TAL1干擾位點(STIL)等11個基因與MCPH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且其中大多數(shù)基因編碼與有絲分裂紡錘體相關(guān)的中心體或中心體蛋白質(zhì)[27]。MCPH臨床主要表現(xiàn)為小頭畸形和非進(jìn)行性神經(jīng)發(fā)育遲滯。在由ASPM基因突變導(dǎo)致的小頭畸形患者中有較高頻率的癲癇發(fā)作，但其他類型罕見[28]。研究[29，30]表明最近發(fā)現(xiàn)的MCPH基因SIL / STIL與Shh信號通路密切相關(guān)，已經(jīng)通過免疫熒光顯微鏡確定STIL - / -小鼠胚胎缺乏中心粒和原發(fā)性纖毛，而Shh信號通路的激活和傳導(dǎo)依賴于原發(fā)性纖毛的形成。STIL在細(xì)胞質(zhì)中與SuFu相互作用以調(diào)節(jié)Shh信號，參與MCPH的形成[31]。

3.4 Shh在Feingold 綜合征、JS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制 Feingold綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病。它的特點是小頭癥、食管和十二指腸閉鎖，常伴有學(xué)習(xí)障礙或智力遲鈍，少數(shù)患者中還伴有肛門閉鎖、椎體異常、心臟畸形和耳聾、腎囊性發(fā)育不良。Feingold綜合征可分為1型和2型，均可表現(xiàn)為小頭癥、學(xué)習(xí)障礙或智力遲鈍等。1型主要由癌基因MYCN突變引起，定位在2p24，2型在染色體13q31.3上發(fā)現(xiàn)有MIR17HG基因的半合子缺失。

研究[32]發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Shh突變及其下游效應(yīng)因子Gli2和Gli3的改變可以導(dǎo)致氣管、食道、腎、椎骨和心臟的異常，其中小頭畸形反映背側(cè)端腦的生長和發(fā)育減少。Shh-/- 小鼠可以具有前腦部分缺失的表征，這表明胚胎期腹側(cè)端腦發(fā)育的紊亂，小鼠Gli3-/-也有異常發(fā)育的端腦。因此，Shh突變及其下游效應(yīng)器的突變可導(dǎo)致在人和小鼠中與Feingold綜合征各種畸形一致的表型。

JS是具有常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳的先天性小腦共濟(jì)失調(diào)，其診斷標(biāo)志是頭顱MRI中獨特的小腦和腦干畸形“臼齒標(biāo)志”。迄今為止，已經(jīng)鑒定了21個致病基因，所有致病基因均可編碼初級纖毛及其相關(guān)蛋白質(zhì)，在脊椎動物中Shh信號通路許多核心成分，如Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)、Sufu和Gli轉(zhuǎn)錄因子，均要定位于纖毛上，纖毛功能障礙可導(dǎo)致Shh通路嚴(yán)重破壞[5]。幾個JS相關(guān)基因中的突變已經(jīng)與Shh信號異常傳導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，并且這些基因敲除的小鼠顯示了一系列與Shh缺失相關(guān)的表型，包括一系列腦發(fā)育異常如神經(jīng)管背部和閉合缺陷、腦畸形、后肢畸形等[33]。有研究[34]對人類JS胎兒樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在不同基因突變引起的JS、MKS或Jeune綜合征患者妊娠16周后，胎兒小腦顆粒祖細(xì)胞的增殖顯著減少，同時與正常組相比Gli1 mRNA和Ptc蛋白水平降低或不可檢測，表明Shh信號通路的異常與JS綜合征小腦發(fā)育不良有關(guān)。

綜上所述，MCD的發(fā)生、發(fā)展涉及許多信號通路的激活。Shh信號通路的異常在MCD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，Shh途徑的各種成分缺失將導(dǎo)致胚胎死亡或具有明顯的畸形，基因敲除動物模型在研究Shh信號通路功能方面具有極大幫助。但目前關(guān)于Shh信號通路與MCD的關(guān)系仍未完全闡明，如Shh信號通路對不同類型皮質(zhì)發(fā)育畸形的影響，其具體作用蛋白及調(diào)控機(jī)制，是否涉及其他信號通路的激活，同時Shh信號通路本身仍存在疑惑，如上游hh信號的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機(jī)制，Ptc究竟是通過何種機(jī)制對Smo進(jìn)行調(diào)控，通路中磷酸化事件的具體作用等。