王鳳平，朱梓年，張霆，張拔山

(東莞市人民醫(yī)院，廣東東莞523000)

目前，碳青霉烯類藥物是治療腸桿菌科細(xì)菌感染最強(qiáng)效的β-內(nèi)酰胺類藥物[1,2]。一旦細(xì)菌發(fā)生碳青霉烯類藥物耐藥，嚴(yán)重影響臨床治療效果[3,4]。全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示，2015年我國耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌(CRE)發(fā)生率約為7.6%，且呈逐年上升趨勢。肺炎克雷伯菌是引起醫(yī)院感染的臨床分離率最高的細(xì)菌之一。了解耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的同源性，掌握其流行病學(xué)特點(diǎn)，可以有效的防止CRE在我國的播散。當(dāng)前，常用的分子流行病學(xué)分析的方法包括限制性內(nèi)切酶聯(lián)合脈沖場凝膠電泳(PFGE)、隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(RAPD)、腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR(ERIC-PCR)、基因外重復(fù)回文序列PCR(REP-PCR)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和多位點(diǎn)核酸序列測定(MLST)等。其中PFGE和MLST的分型結(jié)果準(zhǔn)確，被譽(yù)為分子流行學(xué)分析細(xì)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，但這兩種方法對技術(shù)設(shè)備要求高、檢測周期長、費(fèi)用高，限制了其在基層醫(yī)院中的開展和大規(guī)模應(yīng)用。目前關(guān)于PFGE、MLVA和ERIC-PCR在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的應(yīng)用情況相關(guān)報(bào)道較少。2013年1月～2015年12月，本研究比較了PFGE、MLVA和ERIC-PCR對耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型效果，旨在尋求一種或兩種可以應(yīng)用于基層醫(yī)院的同源性分析的方法。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選擇東莞市人民醫(yī)院2013年～2015年間臨床分離的20株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌，菌株均保存于脫脂牛奶，-70 ℃低溫。實(shí)驗(yàn)前把菌株從脫脂牛奶復(fù)蘇到血平板，再從血平板中挑取純菌株的單個菌落于250 μL的無菌蒸餾水中配成細(xì)菌懸液，備用。全部20株復(fù)蘇菌株在培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)后生長狀態(tài)良好。

1.2 耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型方法

1.2.1 PFGE分型方法 參照國際實(shí)驗(yàn)室分子分型監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)PulseNet中肺炎克雷伯菌PFGE分型標(biāo)準(zhǔn)化方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5,6]。用bioMérieux DENSIMAT比濁儀調(diào)整細(xì)菌懸液濃度，使?jié)岫葹?.8～4.0。加入1% Seakem Gold:1% SDS膠，混勻制備膠塊。使用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液(CLB)消化2 h。純水清洗膠塊2次；TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA，pH值8.0)清洗膠塊4次。使用45U XbaⅠ(TAKARA公司)內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，37 ℃孵育2 h。在CHEF-DR Ⅲ(Bio-Rad Laboratories公司)電泳儀中進(jìn)行脈沖場電泳。電泳參數(shù)為6～36 s，18.5 h。電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色。在讀膠儀中成像，并轉(zhuǎn)換成TIFF圖像格式保存。PFGE圖像錄入BioNumerics軟件包進(jìn)行處理，識別圖像條帶，經(jīng)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。分子量標(biāo)準(zhǔn)用H9812經(jīng)過XbaI酶切后的片段。

1.2.2 MLVA分型方法 使用Quigen細(xì)菌核酸提取試劑盒提取20株細(xì)菌的DNA。使用參考文獻(xiàn)中的8對引物[7]，引物見表1。分別對20株菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中10×PCR緩沖液2 μL, MgCl21.25 μL,dNTP1.6 μL,引物0.5 μL, DNA模板0.5 μL, TaqDNA聚合酶1 U，滅菌雙蒸水14 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中(含0.5 μg/mL溴化乙錠)，電壓為5 V/cm,電泳60 min。凝膠成像儀觀察結(jié)果。將片段大小作為字符，導(dǎo)入BioNumerics軟件包進(jìn)行處理，構(gòu)建最小生成樹。

表1 MLVA分型所用的引物序列

1.2.3 ERIC-PCR分型方法 使用Quigen細(xì)菌核酸提取試劑盒提取DNA。引物：ERIC-2序列：aagtaagtgactggggtgagcg[8]。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中10×PCR緩沖液2 μL, MgCl2 1.25 μL,dNTP1.6 μL,引物0.5 μL, DNA模板0.5 μL, TaqDNA聚合酶1 U，滅菌雙蒸水14 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s, 52 ℃退火45 s, 72 ℃延伸4 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中(含0.5 μg/mL溴化乙錠)，電壓為5 V/cm，電泳90 min，凝膠成像儀觀察結(jié)果。圖譜錄入BioNumerics軟件包進(jìn)行處理，識別圖像條帶，進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。

1.3 Simpson差異指數(shù)測算 采用BioNumerics軟件進(jìn)行同源性分析，測算各方法Simpson差異指數(shù)(D值)，計(jì)算公式為D=1-{∑[nj (nj-1)]}/ [N (N-1)]，其中nj為屬于第j個型別的菌株數(shù)，N為特定群體中的總菌株數(shù)。D值介于0～1之間，D值越趨于1表示該方法分辨力越好。

2 結(jié)果

2.1 PFGE分型結(jié)果 20株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌最終分為18個PFGE型，其中2個帶型包含2株菌，其余16個帶型分別只包含1株菌。其中1號和12號、2號和7號兩組菌分別具有相同的PFGE型別，提示1號和12號、2號和7號之間可能存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。

2.2 MLVA分型結(jié)果 20株菌的MLVA分型結(jié)果顯示20株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌最終分為17個MLVA型，其中3個型別分別包含2株菌，其余16個型別只包含1株菌。以差異位點(diǎn)為小于等于2個位點(diǎn)作為構(gòu)建MLVA群的標(biāo)準(zhǔn)，20株菌中構(gòu)建出4個MLVA克隆群。

2.3 ERIC的分型結(jié)果 20株菌分為14個ERIC型，其中優(yōu)勢型別包含5株菌(6、11、12、13、18)，次優(yōu)勢型別包含3株菌(7、8、14)，其余12個型別分別只包含1株菌。

2.4 PFGE、MLVA、ERIC-PCR三種分型方法的比較 PFGE、MLVA和ERIC-PCR法對耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的D值分別為0.989 5、0.984 2、0.931 6。

3 討論

PFGE是一種分型能力較高的分子流行病學(xué)調(diào)查工具[5,6]。它用限制性位點(diǎn)相對少的酶消化細(xì)菌的基因組，得到數(shù)量相當(dāng)少但更大的限制性片段，采用了兩個交變電場電泳，穿過瓊脂糖的電場作周期性的改變，使得DNA分子的電泳方向隨著電場的變化而變化，大分子DNA得以分離，最后可以產(chǎn)生一個有5～20條清晰的分辨較好的圖譜。PFGE方法的分辨力和可重復(fù)性都很高，是腸球菌、腸桿菌和葡萄球菌基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。從本研究的研究結(jié)果看到，20株肺炎克雷伯菌被分為18個PFGE型，D值為0.989 5，說明PFGE具有較好的分型能力。但PFGE操作中必須使所有酶與緩沖液浸透凝膠塊，完成鑒定時間較長，且不適合沒有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室。同時PFGE專業(yè)設(shè)備昂貴，試劑價(jià)格高，嚴(yán)重影響了PFGE在基層醫(yī)院的應(yīng)用。

MLVA是依據(jù)基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)的特征來達(dá)到菌株基因分型的目的。VNTR是指由一段核苷酸序列(核心序列)多次串聯(lián)重復(fù)所形成的高度可變區(qū)域[9,10]，其結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成，中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)，中間的核心區(qū)為串聯(lián)重復(fù)單位，每個重復(fù)單位在兩個到幾十個堿基之間，重復(fù)2～20次。MLVA分型技術(shù)采用了多重PCR擴(kuò)增技術(shù)，能對多個VNTR位點(diǎn)同時進(jìn)行分析，結(jié)果以數(shù)字方式輸出，通過相關(guān)電腦軟件進(jìn)行聚類分析，分析所用的儀器也較簡單，易獲得，幾乎整個過程都可以由計(jì)算機(jī)自動化處理。且與PFGE相比，MLVA分型結(jié)果采用較簡便數(shù)字形式，有助于細(xì)菌的分子流行病學(xué)研究。在本研究中20株肺炎克雷伯菌被分為17個MLVA型，D值0.984 2。與“金標(biāo)準(zhǔn)”PFGE相比，D值只差了0.005 3，說明MLVA分型能力與PFGE十分相近。本實(shí)驗(yàn)的MLVA以差異位點(diǎn)為小于等于2個位點(diǎn)作為構(gòu)建MLVA群的標(biāo)準(zhǔn)，20株菌中構(gòu)建出4個MLVA克隆群。可以通過菌株的流行病學(xué)信息和其他生物學(xué)信息進(jìn)一步尋找各克隆群的特征。相對PFGE來說，MLVA相對客觀，易于操作，并且可在短時間內(nèi)就可以獲得較好的結(jié)果。另外，MLVA一次可以處理大量的樣品，可以將PFGE有時不能區(qū)分的具有不可分辨電泳模式的菌株精確區(qū)分。同時，MLVA分型只需要普通的PCR儀和電泳儀等簡單的設(shè)備，價(jià)格也相對便宜，這十分適用于普通的醫(yī)院。

ERIC-PCR分型技術(shù)是以腸桿菌科基因間重復(fù)序?yàn)橐镞M(jìn)行PCR，能擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜，根據(jù)擴(kuò)增出來的條帶大小和數(shù)目進(jìn)行分型。ERIC-PCR條件相對簡單，只需要簡單的PCR儀和電泳儀，而且重復(fù)性較好，此方法已由國內(nèi)外許多學(xué)者將其與PFGE、RAPD和限制性內(nèi)切酶等DNA分型技術(shù)進(jìn)行比較，其分辨率與PFGE 高度一致[11]。在本研究中20株肺炎克雷伯菌被分為14個基因型，D值為0.931 6。并且可以通過菌株的流行病學(xué)信息和其他生物學(xué)信息進(jìn)一步尋找各型別(尤其是優(yōu)勢型別和次優(yōu)勢型別)的特征。雖然其分型能力相對于PFGE和MLVA來說稍微遜色一點(diǎn)，但它只需要一條腸桿菌科細(xì)菌通用的引物，不需要針對每種不同細(xì)菌再進(jìn)行引物的合成，是三者中條件設(shè)備最為簡單的方法。這在基層醫(yī)院尤為適用。

另外，從本研究的PFGE分型結(jié)果可以看到，20株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌一共被分為18個PFGE型，其中16個帶型分別只包含1株菌。這說明這些耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌大部分都是散發(fā)存在的。但是，這其中的1號和12號、2號和7號兩組菌分別具有相同的PFGE型別，提示1號和12號、2號和7號之間可能存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。這四株細(xì)菌必須引起重視，它們之間可能存在克隆的關(guān)系。

綜上所述， PFGE、MLVA和ERIC-PCR對耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型結(jié)果均較好。MLVA、ERIC-PCR的分型結(jié)果與PFGE相近，且需要的條件設(shè)備簡單、價(jià)廉，可應(yīng)用于基層醫(yī)院進(jìn)行細(xì)菌的同源性分析，有利于預(yù)防和控制耐藥菌株的擴(kuò)散。