何浩強，陳 光，高嘉良，王 階＊＊

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心血管科 北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院 北京 100029）

證候是中醫(yī)辨證論治的基礎(chǔ)與核心，是中醫(yī)理論的精粹部分。證候研究是中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究、臨床實踐和現(xiàn)代化進程的關(guān)鍵一環(huán)。證候生物學基礎(chǔ)研究又是證候研究中必不可少的部分，也是證明中醫(yī)科學性的重要前提。目前，學者運用傳統(tǒng)中醫(yī)方法并結(jié)合現(xiàn)代科學技術(shù)，從整體、細胞、分子等多個層面，生理、生化、超微結(jié)構(gòu)等多個方面對證候生物學基礎(chǔ)做了相關(guān)探索。尤其在進入后基因組時代之后，有學者[1]提出中西醫(yī)可能在尋找疾病的共性物質(zhì)基礎(chǔ)時在基因水平上找到兩者的結(jié)合點，為證候生物學基礎(chǔ)研究進一步指明方向。目前證候生物學基礎(chǔ)研究[2]在分子層面的基本思路是以探索基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組表達異常及特異代謝組分，探尋證候物質(zhì)基礎(chǔ)—“生物標志物群”為目的。其中，轉(zhuǎn)錄組是聯(lián)系基因組與蛋白組的樞紐。研究轉(zhuǎn)錄組不僅可以解讀基因組的功能元件，揭示細胞或組織的分子成分，也可以理解細胞、組織生長和疾病發(fā)展的過程[3]，同樣有利于解釋證候—中醫(yī)疾病發(fā)展過程中某一階段的病理概括—的發(fā)生發(fā)展機制。近年來，應(yīng)用現(xiàn)代組學技術(shù)與方法，中醫(yī)證候在轉(zhuǎn)錄組學的研究取得一定進展，主要集中在轉(zhuǎn)錄組差異表達，轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)兩個方面，為總結(jié)其經(jīng)驗以促進證候轉(zhuǎn)錄組學的進一步研究，現(xiàn)對相關(guān)國內(nèi)外文獻進行如下綜述。

1 轉(zhuǎn)錄組學內(nèi)涵及研究方向

轉(zhuǎn)錄組學（Transcriptomics）是在整體水平上研究特定階段或生理狀態(tài)下某一細胞或組織所有基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的一門學科[4]。狹義的轉(zhuǎn)錄組是指編碼蛋白質(zhì)的信使RNA（messenger RNA，mRNA），廣義的轉(zhuǎn)錄組則是指從基因轉(zhuǎn)錄的RNA總和，包括mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA,ncNRA）。研究顯示，人體超過93%的基因轉(zhuǎn)錄成RNA，其中只有2%轉(zhuǎn)錄成mRNA，其余為ncRNA[5]，ncRNA在基因調(diào)控中扮演重要的結(jié)構(gòu)和功能角色。根據(jù)功能差異，ncRNA又可分為：①看家非編碼RNA，包括較熟悉的核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA，以及小核RNA、小核仁RNA等；②調(diào)控性非編碼RNA，包括研究較多的微小RNA（microRNA，miRNA），長鏈非編碼RNA（long ncRNA，lncRNA），以及小干擾RNA，PIWI蛋白相互作用RNA等[6-8]。

轉(zhuǎn)錄組學研究的主要目的包括：對所有轉(zhuǎn)錄本進行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如起始位點，5′和3′端，剪接形式及其它轉(zhuǎn)錄后修飾等；量化細胞或組織在發(fā)育過程和不同情況下基因差異表達的水平。通過轉(zhuǎn)錄組分析，可以揭示基因表達與生命現(xiàn)象的內(nèi)在聯(lián)系，對理解機體發(fā)育和病理生理機制具有重要作用[3]。目前，轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)成為揭示疾病的基因突變規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制、發(fā)現(xiàn)致病基因調(diào)控的關(guān)鍵靶點等領(lǐng)域的主要研究手段，廣泛應(yīng)用于疾病預防、診斷、個性化治療和預后等領(lǐng)域[9]。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)主要應(yīng)用于證候?qū)W研究、中藥復雜體系研究、中藥材鑒別、以及中藥材活性成分生物合成和調(diào)控研究等方面[10]。在證候研究中，又以探索轉(zhuǎn)錄組能否成為證候診斷、分型、干預生物標志物可能性為主要內(nèi)容。近期，有學者提出病證結(jié)合的生物標志物研究思路與方法，為中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組研究提供了新的啟發(fā)[11]。

2 中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組學研究的相關(guān)技術(shù)

2.1 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)，又稱DNA微陣列技術(shù)，即通過將待測RNA片段逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（complementary DNA），并用熒光標記，然后與芯片上已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定，最后通過檢測樣品熒光信號強弱測定基因表達水平的技術(shù)，包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片[12]等。目前，該技術(shù)主要用于基因表達譜分析、基因突變及基因多態(tài)性表達譜分析、檢測可變剪接模式等[13,14]，在醫(yī)學領(lǐng)域則被用于疾病分類診斷，藥理毒理研究，藥物靶點篩選及藥效分析[15-17]?；蛐酒夹g(shù)發(fā)展較為成熟，具有高度平行性、高效性、自動化等特點，其優(yōu)勢在于對基因表達水平估計快速準確，數(shù)據(jù)分析軟件及理論成熟[18]，但在新基因檢測與靈敏度上較測序技術(shù)差[19-21]。在證候轉(zhuǎn)錄組學研究方面，主要集中在分析不同證型間的差異基因表達水平，一般以mRNA、miRNA、lncRNA的差異表達為研究對象。

2.2 RNA測序技術(shù)

RNA測序技術(shù)，又稱RNA-seq技術(shù)，是將新一代高通量測序技術(shù)應(yīng)用于RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，從而獲得來自不同基因的RNA片段在特定樣本中的含量的技術(shù)，包括Solexa合成測序技術(shù)、454焦磷酸測序技術(shù)、SOLiD連接測序技術(shù)以及單分子測序技術(shù)等[22]，其過程是將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫，將cDNA隨機剪切為小片段，在cDNA兩端加上接頭利用高通量測序儀測序，將獲得序列通過比對或從頭組裝形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜[3]。目前，該技術(shù)主要用于基因表達譜分析、RNA結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)變異研究、非編碼區(qū)域功能研究和新基因發(fā)現(xiàn)等[23]，在生物學研究、臨床研究和藥物研究等領(lǐng)域被廣泛使用[3,24]。RNA-seq是測序技術(shù)飛速發(fā)展的新時代產(chǎn)物，具有數(shù)字化信號、高靈敏度、檢測范圍廣等特點，其優(yōu)勢在于無需預先設(shè)計探針，可對任何物種進行全轉(zhuǎn)錄組分析，但因測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)尚缺乏成熟的數(shù)據(jù)處理模型以及測序片段讀長較短是目前的主要挑戰(zhàn)[3]。

3 中醫(yī)證候與轉(zhuǎn)錄組差異表達研究

證候是疾病發(fā)展過程中某一階段的病理概括[25]，證候的出現(xiàn)必然存在著與形成疾病證候病理變化相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)或功能的改變[11]?，F(xiàn)代研究顯示轉(zhuǎn)錄組與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系[5]，其表達水平在不同病理和特定狀態(tài)下具有顯著差異。近些年，很多學者將轉(zhuǎn)錄組學引入證候研究，通過芯片或測序技術(shù)觀察和篩選不同證候間差異表達的轉(zhuǎn)錄組，再根據(jù)已有的基因數(shù)據(jù)庫注釋信息，對其進行生物信息學分析，歸納其參與的生物過程與信號通路，試圖發(fā)現(xiàn)證候的生物學基礎(chǔ)。目前主要在mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA層面做了相關(guān)研究，取得一定進展。

3.1 mRNA

mRNA是由DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄，攜帶遺傳信息并能指導蛋白質(zhì)合成的一類核糖核酸，其結(jié)構(gòu)包括5′帽子、非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3′PolyA尾，除了傳遞遺傳信息，編碼蛋白質(zhì)（肽鏈）功能外[26]，還被發(fā)現(xiàn)是一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），參與基因表達的調(diào)控[27]。mRNA差異表達與各系統(tǒng)疾病均存在一定聯(lián)系[28-30]，用于臨床診斷、疾病分型、個性化治療等方面[30,31]。中醫(yī)證候的mRNA差異表達研究包括冠心病血瘀證[32]，HIV/AIDS氣陰兩虛和濕熱內(nèi)蘊證[33]，慢性乙型肝炎肝郁脾虛證和脾胃濕熱證[34]等。

陳氏等[32]運用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片和RT-PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）調(diào)查冠心病血瘀證差異表達譜，結(jié)果共有107條基因存在差異表達，上調(diào)基因48條，下調(diào)基因59條，通過GO（Gene Ontology）和信號通路分析，發(fā)現(xiàn)其中有14條差異基因和4/15的信號通路與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)。張氏等[33]運用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0 Chips芯片技術(shù)分析HIV/AIDS氣陰兩虛和濕熱內(nèi)蘊證基因差異表達，結(jié)合基因功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證共有113條基因差異表達（41條上調(diào)，72條下調(diào)），與細胞活動、通訊、蛋白質(zhì)定位、細胞離子穩(wěn)態(tài)和細胞運動調(diào)節(jié)等功能有關(guān)，濕熱內(nèi)蘊證共有76條基因差異表達（14條上調(diào)，62條下調(diào)），與細胞應(yīng)激反應(yīng)，以及造血或淋巴器官發(fā)育等功能有關(guān)。范氏等[34]采用Aglient表達譜芯片篩選慢性乙型肝炎肝郁脾虛證和脾胃濕熱證患者的差異表達基因，并通過GO、Pathway、Genbank等數(shù)據(jù)庫對差異基因進行分析和動態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果找到共表達能力差異最顯著的9個基因（LOC340508、HIST2H2BE、MPL、FLJ22536、TUBA8、NT5M、EGFL7、PTPRF、TSPAN33），主要涉及免疫反應(yīng)、細胞生長、DNA損傷、信號轉(zhuǎn)導、炎癥反應(yīng)等生命過程。

3.2 MiRNA

MiRNA是一類長度為19-23個核苷酸（nucleotide，nt）的非編碼RNA，具有高度序列保守性、時序性和組織特異性等特點，以及調(diào)控基因表達，調(diào)節(jié)細胞早期發(fā)育，參與細胞分化、增殖和凋亡等生物學功能。醫(yī)學研究顯示，miRNA差異表達在腫瘤、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病呈現(xiàn)一定規(guī)律，目前被應(yīng)用于疾病診斷，個性化治療和預后判斷中[35-37]。一些學者將其用于證候研究，分析了冠心病血瘀證[38]、高血壓血瘀證[39]、乙型肝炎肝膽濕熱證和肝腎陰虛證[40]、胰腺癌濕熱證[41]miRNA的差異表達。

王氏等[38]使用Agilent RNA 6000 Nano assay芯片和實時熒光定量PCR技術(shù)分析了冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證miRNA差異表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p，miR-199a-5p在血瘀證組表達顯著上調(diào)（P＜0.01），認為其可能成為血瘀證診斷的生物標志物。何氏等[39]使用Illumina HiSeq2000測序和qRT-PCR技術(shù)篩選了高血壓血瘀證相關(guān)miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p和miR-1283在血瘀證組表達顯著下調(diào)（P＜0.05），因此認為其可能是高血壓病血瘀證形成的特異性相關(guān)miRNA。張氏等[40]使用Agilent Human miRNA microarray V3芯片和qRT-PCR技術(shù)，分析了慢性乙型肝炎肝膽濕熱證、肝腎陰虛證患者與健康人血清miRNA差異表達，結(jié)果顯示miR-583和miR-663分別在肝膽濕熱證和肝腎陰虛證患者血清中顯著上調(diào)（P＜0.001），溶解曲線結(jié)果提示指標具有較好靈敏度和特異度，可被用作證型區(qū)分的標志性分子。高氏等[41]采用qRT-PCR技術(shù)檢測胰腺癌濕熱證、脾虛證和無證型患者唾液中miR-21、miR-181a表達水平，結(jié)果顯示miR-21、miR-181a在濕熱組表達水平顯著降低。同時，高氏研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌濕熱證患者預后較好，因此推斷miR-21、miR-181a可能作為胰腺癌預后判斷的指標之一。

3.3 LncRNA

長鏈非編碼RNAs通常指長度超過200 nt的非編碼RNA，其序列保守性較低，表達具有組織和時空特異性。lncRNA參與染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)運輸、細胞分化等多種生物過程，與冠狀動脈疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等具有一定關(guān)聯(lián)性，被應(yīng)用于疾病診斷、判斷預后、藥物靶標研究等生物醫(yī)學領(lǐng)域[42,43]。目前證候研究方面，主要是對冠心病血瘀證[44]，乳腺癌肝郁證[45]，肺結(jié)核[46]不同證候的lncRNA 差異表達譜的研究。

王氏等[44]采用Illumina HiSeq 2 500測序和qRTPCR技術(shù)篩選冠心病血瘀證相關(guān)差異表達lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證組39個lncRNA差異表達（Fold change＞2，p-value＜0.05），其中3個lncRNA上調(diào)，36個lncRNA下調(diào)。許氏等[45]采用Human IncRNA MicroarrayV3.0芯片和qRT-PCR技術(shù)篩選乳腺癌及其肝郁證相關(guān)IncRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNARP4-583P15.10和lncRNARPll-445H22.4與乳腺癌的發(fā)展和進展有關(guān)，進一步分組分析發(fā)現(xiàn)lncRNARPll-445H22.4在肝郁證組中明顯上調(diào)（P＜0.001）且溶解曲線分析提示敏感度和特異度較好，具有作為乳腺癌肝郁證患者早期診斷生物標志物的潛力。Jiang等[46]運用Human LncRNA Microarray V3.0分析肺結(jié)核患者不同證候的lncRNA表達譜，結(jié)果顯示肺陰虛證有566個lncRNA、肝火傷陰證有55個lncRNA、氣陰兩虛證60個lncRNA存在差異表達（Fold change＞2，p-value＜0.05）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）通路分析顯示差異表達基因與Hippo信號通路以及蛋白質(zhì)消化、吸收途徑有關(guān)。

4 中醫(yī)證候與轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

證候表現(xiàn)是基因表達成蛋白質(zhì)，并由蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學效應(yīng)的結(jié)果，基因表達受多環(huán)節(jié)、多因素調(diào)控，解析基因表達的調(diào)控對于理解證候的發(fā)生、轉(zhuǎn)化具有重要的作用?；虮磉_的調(diào)控是一個復雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是目前研究的熱點。一些研究[47]已經(jīng)闡明了miRNA-mRNA通過多重網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因表達的復雜機理。miRNA是關(guān)鍵的基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。最新研究[27]表明，不同種類的RNA之間存在相互作用關(guān)系，且都可以憑借miRNA海綿的角色調(diào)控基因表達。這些RNA分子統(tǒng)稱為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），它們通過與“共享”的miRNA競爭性結(jié)合互相傳遞信息或者互相調(diào)控。進一步探索ceRNAs之間調(diào)控關(guān)系將對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生新的認識，也對人類的發(fā)展和疾病具有重要意義，對于闡明證候機制亦是同等重要。一些學者在證候的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面也進行了探索性研究并取得一定成果，主要涉及 miRNA-mRNA[38,48]，lncRNA-miRNA-mRNA[44]調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但總體來講，研究的數(shù)量和深度尚且不足。

王氏等[38]采用Agilent RNA 6000 Nano assay芯片技術(shù)篩查血瘀證患者miRNA和mRNA差異表達，發(fā)現(xiàn)401個mRNA和11個miRNA差異表達，然后運用miRWalk軟件根據(jù)miRNA預測相關(guān)靶基因并參照差異表達mRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p，miR-199a-5p和23個目標mRNA形成了血瘀證的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（P＜0.01），經(jīng)另一獨立隊列的qRT-PCR驗證得到相同結(jié)果，因此認為該網(wǎng)絡(luò)可用于血瘀證診斷。王氏等[49]又通過血塞通治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證觀察其對miR-146b-5p和miR-199a-5p及其富集的干預抗原呈遞和處理通路、p53信號通路和NK細胞介導的細胞毒性作用通路上的靶基因（KIR3DS1,HLA-DPB1,TP53SESN2,NCR1,PRF1）的影響，治療前后結(jié)果經(jīng)qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p、miR-199a-5p可作為診斷標志物，且靶基因的變化趨勢提示miR-146b-5p、miR-199a-5p可以影響以上3條信號通路。另外，王氏等[44]采用Illumina HiSeq 2500測序和qRT-PCR技術(shù)進一步篩選冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示冠心病血瘀證相關(guān)差異基因包括39個lncRNA，229個miRNA和221個mRNA。通過聯(lián)合Pearson相關(guān)分析和starBase數(shù)據(jù)庫預測獲得的基因間調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建lncRNA，miRNA，mRNA之間的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。符合共調(diào)控條件的共有9個lncRNA，31個mRNA和24個miRNA構(gòu)成共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括76個基因間調(diào)控關(guān)系。此外，武氏等[48]采用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0芯片技術(shù)分析HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊證miRNA和mRNA表達情況，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了105對mRNA-miRNA，73條靶基因，靶基因主要參與對組織反應(yīng)、調(diào)節(jié)增殖、凋亡等。

5 中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組學的挑戰(zhàn)和前景

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，使得我們能夠從轉(zhuǎn)錄組學的層面認識證候，但轉(zhuǎn)錄組學蘊含龐大且復雜的信息給證候研究帶來新的挑戰(zhàn)：其一，高通量芯片和測序技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)與證候本身的復雜性使生物信息學處理與數(shù)據(jù)分析困難化；其二，研究多通過少量樣本尋找差異表達的RNA而未進行大樣本量的驗證，或驗證與篩選結(jié)果不一致使結(jié)論可信度降低；其三，即使篩選得到差異RNA，但缺乏“證候模型”下的細胞功能學驗證使發(fā)生機制尚不明確；其四，使用轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究證候復雜系統(tǒng)，使復雜模型更加復雜化；其五，病證結(jié)合模式下的簡單分組對照研究，無法甄別差異RNA為疾病特異性還是證候特異性使結(jié)果模糊化。針對以上問題，亟需研究者深入思考并加以改進，比如保持轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)與組學數(shù)據(jù)處理分析方法的更新，規(guī)范證候轉(zhuǎn)錄組研究的流程與方法，優(yōu)化證候差異RNA篩選的分組設(shè)計方案等等。另外，環(huán)狀RNA[50]已作為新發(fā)現(xiàn)的ceRNA被廣泛用于西醫(yī)疾病研究，其高度保守性可能更利于臨床檢測，能否將其引入中醫(yī)證候研究也需進一步探索。

雖然中醫(yī)證候的轉(zhuǎn)錄組學研究還面臨諸多挑戰(zhàn)，但憑借高通量芯片、新一代測序及其它組學技術(shù)，中醫(yī)證候研究在轉(zhuǎn)錄組學層面以取得一定進展，通過分析轉(zhuǎn)錄組的差異表達和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，已發(fā)現(xiàn)部分證候相關(guān)RNA和轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點，它們將扮演證候生物標志物角色或用于闡明證候發(fā)生機制。借助此類研究，可為證候生物學基礎(chǔ)研究開辟新的道路，也能為進一步實現(xiàn)證候的早期診斷、早期治療以及促進中醫(yī)藥精準化醫(yī)療奠定夯實基礎(chǔ)。

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