張 璇，魏克強，楊進(jìn)文

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

煙草的化學(xué)成分直接影響卷煙制品的安全性和可用性，其形成與品種類型、栽培措施、生態(tài)環(huán)境等因素密切相關(guān)[1-3]。研究表明，不同基因型煙草品種的化學(xué)成分存在較大差異；香煙煙霧氣溶膠含有近5 000種化學(xué)成分，其中,1/3直接來源于煙草本身，而2/3則是在香煙的燃燒、裂解、蒸餾、冷凝等一系列物理化學(xué)作用中新產(chǎn)生的[4]。采用體外毒理學(xué)評價方法，即哺乳動物細(xì)胞系細(xì)胞毒性分析（中性紅試驗）、細(xì)菌誘變分析（Ames試驗）和細(xì)胞遺傳學(xué)分析（微核試驗），以及“特定機體損傷”即慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的動物模型評價方法，山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室發(fā)現(xiàn)不同基因型煙草的毒理學(xué)效應(yīng)差異顯著[5-7]，這對培育低毒少害的煙草新品種具有一定的指導(dǎo)意義。

COPD是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，吸煙被認(rèn)為是誘發(fā)COPD最主要的危險因素[8-9]，其致病機制涉及免疫應(yīng)答失衡、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、細(xì)胞增殖/凋亡失衡等，在疾病進(jìn)程中多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子、信號通路發(fā)揮了重要作用[10-11]。特別是，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）參與了細(xì)胞應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生理和病理過程，是多條信號途徑的交匯點和共同通道，其表達(dá)的變化有可能作為評價煙草毒理學(xué)效應(yīng)的潛在標(biāo)志物[12-13]。

本研究以2個基因型的煙草品種為材料，采用單純煙熏法構(gòu)建出大鼠的COPD模型，通過H.E.染色、組織病理學(xué)分析以及p38、磷酸化p38（p-p38）的免疫組化分析，評價了不同基因型煙草對大鼠肺組織的毒理學(xué)效應(yīng)，旨在為揭示空氣污染物暴露的毒理學(xué)機制、建立標(biāo)準(zhǔn)的香煙煙霧毒理學(xué)評價方法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠24只（5周齡，體質(zhì)量約185 g），購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。試驗前在恒溫恒濕條件下暫養(yǎng)7 d，自由飲水與進(jìn)食。2個基因型煙草品種，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室提供，其煙葉由山西昆明煙草有限責(zé)任公司分別卷制成單料煙Y-1和Y-2。

1.1.2 主要試劑與儀器 兔抗大鼠p38，p-p38多克隆抗體，分別購自Proteintech Grope及愛必信（上海）生物科技有限公司；山羊抗兔IgG SABC免疫組化染色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；濃縮型DAB試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；戊巴比妥鈉、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木精等均為國產(chǎn)分析純。

儀器主要有石蠟切片機（Leica RM2255，德國）；ZKPJ-1A展烤片機（天津天利航空機電有限公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51，日本）；HHS-21-4型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 COPD模型構(gòu)建及采樣 將大鼠隨機分為3組：健康對照組（CK）、Y-1組、Y-2組，每組 8只。CK組大鼠僅吸入新鮮空氣，Y-1，Y-2組大鼠置于染毒箱（60 cm×80 cm×100 cm）內(nèi)，分別以卷制的單料煙Y-1，Y-2進(jìn)行60 d的煙霧暴露染毒：每組同時點燃10支煙，通過氣泵和導(dǎo)管裝置將煙霧導(dǎo)入染毒箱，持續(xù)暴露染毒1 h，每天2次，每次間隔4 h，每周染毒6 d。分別于染毒30，60 d后，每組隨機取4只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉，解剖取右肺組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.2 肺組織H.E.染色及病理評分 將固定的肺組織行常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm）、H.E.染色。參考文獻(xiàn) [14]的方法，每張切片隨機選取5個視野于100倍光鏡下觀察肺組織的病理改變，并從7個方面進(jìn)行評分：（1）氣道腔阻塞；（2）氣道上皮糜爛脫落；（3）氣道上皮杯狀化生；（4）氣道上皮鱗狀化生；（5）氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤；（6）氣道壁纖維結(jié)締組織增生；（7）氣道壁平滑肌增生。以上每項從無明顯改變到嚴(yán)重改變分別用0～4分表示，各項評分合計為一個視野的病理評分。

1.2.3 免疫組化法檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟，免疫組化三步法（SABC法）檢測p38，p-p38的表達(dá)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。每張切片中隨機選取5個視野，使用Image-ProPlus 6.0軟件讀取每個視野下陽性物質(zhì)表達(dá)區(qū)域的平均光密度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，所有計數(shù)資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺組織H.E.染色及病理學(xué)評分

觀察結(jié)果顯示，CK組鮮見炎癥細(xì)胞聚集，氣道上皮完整，管腔內(nèi)無黏液分布，管壁無增厚。隨煙霧暴露時間的延長，Y-1組和Y-2組呈現(xiàn)出不同程度的病理改變：暴露30 d后，小氣道周圍出現(xiàn)少量聚集的炎癥細(xì)胞，氣道上皮輕微脫落，上皮細(xì)胞出現(xiàn)鱗狀和杯狀細(xì)胞化生，管腔內(nèi)偶見黏液，氣道壁結(jié)締組織和平滑肌開始增生；煙熏60 d后，Y-1組與Y-2組氣道周圍出現(xiàn)大量聚集的炎癥細(xì)胞，氣道上皮脫落嚴(yán)重，上皮細(xì)胞化生現(xiàn)象頻繁，細(xì)胞排列不規(guī)則，黏膜皺襞增多、黏液分泌導(dǎo)致氣道狹窄、堵塞，氣道壁明顯增厚，表現(xiàn)出COPD典型的病理特征。病理學(xué)評分顯示，與CK組相比，Y-1組與Y-2組的病理改變顯著（P＜0.01）；與Y-2組相比，Y-1組的病理改變更為嚴(yán)重，但差異不顯著（P＞0.05）。這表明，不同基因型煙草釋放的煙霧對COPD進(jìn)程有不同程度的影響（圖1）。

2.2 肺組織p38及p-p38的表達(dá)

免疫組化分析表明，在60 d的疾病進(jìn)程中，各處理組COPD大鼠肺組織的p38表達(dá)水平變化不顯著（P＞0.05）；但與 CK組相比，Y-1組、Y-2組的p38表達(dá)水平均顯著升高，且Y-1組明顯高于Y-2組（P＜0.05）。隨暴露時間的延長，Y-1組、Y-2組的p38磷酸化水平逐漸升高；與CK組相比，Y-1組的p-p38表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；在煙熏30 d時，Y-1組p-p38的表達(dá)明顯高于Y-2組（P＜0.05）。表明香煙煙霧能夠激活大鼠肺組織p38的表達(dá)及其磷酸化，且p38的表達(dá)與活化受不同基因型煙草釋放煙霧的明顯影響。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是哺乳動物介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。MAPK家族主要有3個成員，即細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、應(yīng)激活化蛋白激酶（JUNK）和蛋白激酶p38。其中，p38是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，在應(yīng)激條件下可以被激活而磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)或轉(zhuǎn)移到其他部位，發(fā)揮對氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控[15-16]。

氣道或肺組織對香煙煙霧有害成分或顆粒的異常反應(yīng)是誘發(fā)COPD的最主要原因[8-9]。香煙煙霧能夠損傷肺泡上皮細(xì)胞，受損的肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，將樹突細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化到損傷部位并激活，分泌蛋白酶進(jìn)一步損傷肺組織[17]，這一過程可以誘導(dǎo)p38磷酸化，在疾病進(jìn)程中發(fā)揮不可或缺的作用。而抑制p38 MAPK的激活能有效改善COPD患者的肺功能、降低炎癥介質(zhì)的水平，提示p38可能是藥物治療COPD的潛在靶位點[18-20]。

本研究表明，2個基因型煙草染毒的大鼠，在COPD發(fā)病進(jìn)程中其肺組織的病理變化程度與p38表達(dá)及其磷酸化水平的趨勢基本一致，這可能是由于活化的p38促進(jìn)了炎癥細(xì)胞的聚集、炎癥介質(zhì)的釋放和氧化應(yīng)激的損傷。但肺組織的p38表達(dá)、活化以及病理改變與煙草材料存在密切的相關(guān)性，這可能與不同基因型煙草的化學(xué)成分存在較大差異有關(guān)，p38可能是評價煙草導(dǎo)致“特定機體損傷”的一個潛在標(biāo)志物，這對煙草毒理學(xué)的研究具有重要的意義。

［1］杜文，譚新良，易建華，等.用煙葉化學(xué)成分進(jìn)行煙葉質(zhì)量評價[J].中國煙草學(xué)報，2007，13（3）：25-31.

［2］孫福山，王麗卿.煙葉成熟度及烘烤關(guān)鍵指標(biāo)與煙葉質(zhì)量關(guān)系的研究[J].中國煙草科學(xué)，2002，23（3）：25-27.

［3］王彥亭.中國煙草種植區(qū)劃[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

［4］RICHTER P，PECHACEK T，SWAHN M，et al.Reducing levels of toxic chemicals in cigarette smoke:A new healthy people 2010 objective[J].Public Health Reports，2008，123（1）：30-38.

［5］李佳美.環(huán)境煙霧暴露對SD大鼠主要組織的損傷效應(yīng)研究[D].太原：山西大學(xué)，2016.

［6］張永健，魏克強，楊進(jìn)文.不同基因型煙草的細(xì)胞毒性與致突變性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（3）：374-378.

［7］武娟，魏克強，任建英.不同基因型煙草體內(nèi)外毒理學(xué)效應(yīng)的初步分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：596-599.

［8］JOHN-SCHUSTER G，GüNTER S，HAGER K，et al.Inflammaging increases susceptibilitytocigarette smoke-induced COPD[J].Oncotarget，2016，7（21）：30068-30083.

［9］ CHURG A，COSIO M，WRIGHT J L.Mechanisms of cigarette smoke-induced COPD：insights from animal models[J].American Journal of Physiology Lung Cellular&Molecular Physiology，2008，294（4）：612-31.

［10］MACNEE W.Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease[J].Clinics in Chest Medicine，2007，28（3）：479-513.

［11］DAHESHIAM.Pathogenesis ofchronic obstructive pulmonarydisease（COPD）[J].Clinical&Applied ImmunologyReviews，2005，5（5）：339-351.

［12］RENDA T，BARALDO S，PELAIA G，et al.Increased activation of p38 MAPK in COPD[J].European Respiratory Journal，2008，31（1）：62.

［13］NATH P，LEUNGSY，WILLIAMSA，et al.Importance ofp38 mitogenactivated protein kinase pathway in allergic airway remodelling and bronchial hyperresponsiveness[J].European Journal of Pharmacology，2006，544（1/3）：160-167.

［14］ COSIO M，GHEZZO H，HOGG J C，et al.The relations between structural changes in small airways and pulmonary-function tests[J].NewEngland Journal ofMedicine，1978，298（23）：1277.

［15］ SUN S J，WU X P，SONG H L，et al.Baicalin ameliorates isoproterenol-induced acute myocardial infarction through iNOS,inflammation,oxidative stress and p38MAPK pathwayin rat[J].International Journal of Clinical&Experimental Medicine，2015，8（12）：22063.

［16］NAN Y，CHANG R，JIANG H，et al.Downregulation of p38 phosphorylation correlates with low-grade differentiation and proliferation of lung squamous cell carcinoma[J].American Journal of Translational Research，2017，9（4）：1922.

［17］趙開順.吸煙COPD患者清道夫受體A（SR-A）介導(dǎo)炎癥的影響[D].上海：上海交通大學(xué)，2015.

［18］ GAFFEY K，REYNOLDS S，PLUMB J，et al.Increased phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase in COPD lungs[J].European RespiratoryJournal，2013，42（1）：28-41.

［19］黃翠萍，徐旭燕.慢性阻塞性肺疾病患者p38蛋白激酶表達(dá)的變化及其臨床意義[J].中國老年學(xué)，2012，32（2）：233-234.

［20］吳潔，戴偉，辛?xí)苑?P38MAPK在慢性阻塞性肺疾病中的作用[J].臨床肺科雜志，2015（1）：138-141.