梁 倩，李 璐，安 茜，周雅莉，王計平

（山西農業(yè)大學農學院，山西太谷 030801）

紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.）是雙子葉 1 年生草本植物，是國家衛(wèi)生部第1批頒發(fā)的藥食兩用的中藥植物之一，種子油富含α-亞麻酸[1-2]。目前，紫蘇被認為是一種新型油料作物。

在植物油脂合成過程中，脂肪酸去飽和酶基因FAD2是定位于內質網上的Δ12油酸去飽和酶[3]，是產生多不飽和脂肪酸的關鍵酶基因，調控亞油酸和亞麻酸2種脂肪酸的合成，同時也用來調控植物細胞中大多數不飽和脂肪酸的合成，其催化產物及其衍生物對植物的生長發(fā)育具有重要作用。油酸是植物油脂中主要的單不飽和脂肪酸，在脂肪酸脫氫酶（FAD2）催化下形成亞油酸，而亞油酸是人體所必需的脂肪酸。研究表明，當兒童缺乏亞油酸時，會出現發(fā)育遲緩和濕疹皮炎等癥狀；當成人缺乏亞油酸時，會出現磷狀皮屑、脫發(fā)和傷口難以愈合等癥狀[4-5]。FAD2是催化多不飽和脂肪酸生物合成的第1步反應[6]，在植物種子中，其表達量的多少決定著亞油酸含量的多少。所以，脂肪酸去飽和酶FAD2在不飽和脂肪酸的合成過程中發(fā)揮重要作用。

本研究對紫蘇FAD2基因進行了詳細的生物信息學分析，并分析了該基因在晉紫蘇1號不同組織及不同發(fā)育時期種子中的表達特性，旨在為進一步闡明紫蘇FAD2基因在脂肪酸合成代謝過程中的作用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從紫蘇轉錄組測序數據庫中挑選出功能注釋為FAD2的基因，根據不同物種間同源基因的核酸序列相對保守的特點，將紫蘇中該基因序列與擬南芥FAD2同源序列進行比對分析，最后得到紫蘇FAD2基因全長cDNA序列。

選取由中北大學張志軍老師提供的晉紫蘇1號作為試驗材料，分析不同組織及不同發(fā)育時期的種子（開花后 10，20，30，40 d）中 PfFAD2 基因的表達特性。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫蘇FAD2基因序列及蛋白功能分析 紫蘇FAD2基因編碼蛋白的理化性質通過ProtParam在線軟件分析；親疏水性、跨膜域利用ProtScale在線軟件和TMHMM-2.0在線軟件分析；功能結構域運用 NCBI的 CDD（Conserved Domiand Database）數據庫進行分析鑒定；二級結構預測采用SOPMA在線軟件分析；三級結構分析及建模采用Swiss-Model在線軟件分析。系統(tǒng)進化樹分析運用MEGA6.0多序列比對軟件進行構建。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測 根據紫蘇FAD2基因的cDNA序列設計熒光定量PCR特異引物，cDNA合成采用ABM公司試劑盒，實時熒光定量采用康潤公司GenStar試劑盒。以紫蘇18SrRNA作為內參基因[7]，進行熒光定量PCR檢測。反應體系（10 μL）：2 ×RealStar Green Power Mixture 5 μL，RNase-free H2O 4.4 μL，上下游引物各 0.2 μL，模板cDNA 0.2 μL；反應條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 PfFAD2基因全長cDNA序列及編碼蛋白的理化性質分析

紫蘇FAD2基因全長cDNA序列1 545 bp，ORF為1 149 bp，共編碼382個氨基酸殘基（圖1），紫蘇FAD2蛋白相對分子量為43.668 47 ku；分子式為C2033H3038N516O532S14，原子總數為6 133，脂溶系數為90.29，總平均親水系數為-0.019，不穩(wěn)定系數為36.58，屬于穩(wěn)定性蛋白。

利用ProtScale在線分析FAD2蛋白的親疏水性，結果表明，FAD2蛋白在264位氨基酸殘基處有最高值，是2.622；在369位氨基酸殘基處有最低值，是-3.033，且以0為分界線，0以上代表疏水性氨基酸，0以下代表親水性氨基酸。所以，FAD2蛋白是親水性蛋白（圖2）。

紫蘇FAD2蛋白的跨膜結構表明，FAD2蛋白有6個典型的跨膜螺旋區(qū)，分別在52～69位、82～104位、114～136位、178～195位、222～239位、246～268位氨基酸（圖 3）。

通過NCBI-CDD數據庫對紫蘇FAD2進行功能結構域分析，結果表明，FAD2蛋白含有PLN02505保守結構域，屬于Membrane-FADS-like超蛋白家族（圖 4）。

運用SOPMA對紫蘇FAD2蛋白進行二級結構預測，結果表明，該蛋白的二級結構由α-螺旋（38.37%）、無規(guī)則卷曲（31.41%）、延伸鏈（23.04%）、β-轉角（9.16%）4種結構元件組成。通過SWISS-MODEL在線軟件對該蛋白三級結構進行預測，結果如圖5所示。

利用MEGA 6.0多序列比對軟件對紫蘇（Perilla frutescens）及蓖麻（Ricinus communis）、油桐（Vernicia fordii）、芝麻（Sesamum indicum）、芡歐鼠尾草（Salvia hispanica）、紅花（Carthamus tinctorius）等FAD2蛋白序列進行了比對分析，并構建了系統(tǒng)進化樹，分析結果表明，紫蘇與芡歐鼠尾草的親緣關系較近，與紅花的親緣關系較遠（圖6）。

2.2 PfFAD2基因表達特性分析

為進一步了解FAD2基因在紫蘇不同組織中的表達特性，本研究利用熒光定量PCR技術分析了該基因在晉紫蘇1號不同組織及不同發(fā)育時期的種子中的相對表達量，結果如圖7所示。FAD2在紫蘇的不同組織器官中均有表達，并且在開花后20 d的種子中表達量最高，在其他組織中只是微量表達。

3 結論與討論

脂肪酸去飽和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）屬于ω-6脂肪酸脫氫酶（ω6 fatty acid desaturase），是廣泛存在于植物中的一種能催化油酸（oleic acid，C18∶1Δ9）脫氫生成亞油酸（linoleicacid，LA，C18∶2Δ9，12）的還原酶。亞油酸能有效降低血液中膽固醇含量[8]，是α-亞麻酸、花生四烯酸等重要多不飽和脂肪酸合成的前體，具有廣泛的藥用價值和營養(yǎng)價值[9-11]。PENG等[12]通過對油菜FAD2和FAE1基因的抑制表達研究，結果發(fā)現，油酸含量由15%提高到80%，多不飽和脂肪酸含量降至10%，而對人體有害的芥酸含量則降為0；TOPFER等[13]通過導入FAD2基因的反義基因，阻止FAD2基因表達，結果獲得了油酸含量83%的轉基因油菜。也有研究表明，過表達FAD2基因可以有效提高亞油酸的含量。崔琴琴[14]將FAD2基因導入粘紅酵母中，結果表明，油桐FAD2基因的過表達能夠調節(jié)酵母的亞油酸含量，轉FAD2酵母亞油酸含量分別提高102.85%，81.95%，21.80%。趙娜等[15]在亞油酸缺失的擬南芥fad2突變體中導入文冠果FAD2基因，使得突變體中產生了亞油酸。

為進一步了解FAD2基因在紫蘇脂肪酸合成機制中的調控作用，本試驗對FAD2進行了較為詳細的生物信息學分析，并研究了FAD2在晉紫蘇1號的不同組織及不同發(fā)育時期的種子中的表達特性，結果表明，該基因cDNA全長序列為1 545 bp，共編碼382個氨基酸殘基，紫蘇FAD2蛋白含有PLN02505保守結構域，屬于Membrane-FADS-like超蛋白家族。系統(tǒng)進化樹分析結果表明，紫蘇與芡歐鼠尾草的親緣關系較近，與紅花的親緣關系較遠。周菲等[16]研究了脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1在向日葵種子中的表達特異性，結果顯示，該基因在12～22 d的時候表達量達到高峰。本研究分析結果表明，紫蘇FAD2基因在開花后20 d的種子中高效表達，這與周菲等[16]的研究結果相似。

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