鞏宇航 丁明霞

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科/云南省泌尿外科研究所（昆明 650101）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是世界第九大最常見(jiàn)惡性腫瘤。目前對(duì)于BC的篩查，主要是上尿路造影、尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、CT和膀胱鏡檢查。膀胱鏡檢查是一種對(duì)患者傷害較大的方式，而尿細(xì)胞學(xué)檢查不夠敏感并且依賴于操作。由于血清和血漿相對(duì)容易獲得，循環(huán)生物標(biāo)記是最有前途的診斷手段之一。最近幾年發(fā)現(xiàn)，一部分非編碼RNA可以在循環(huán)血液中被檢測(cè)到，并與BC的發(fā)展相關(guān)，如：microRNA、lncRNA［1-3］。血液中的 RNA 一部分在有核細(xì)胞內(nèi)，另一部分在無(wú)核細(xì)胞內(nèi)即非細(xì)胞RNA，這些非細(xì)胞RNA通過(guò)膜泡結(jié)構(gòu)（凋亡小體，微泡，外泌體）以及非細(xì)胞核糖核蛋白在血液中循環(huán)。外周血或血漿/血清等血液組分中RNA的特異性改變可能是反應(yīng)機(jī)體不同細(xì)胞和組織中生理和病理過(guò)程的指標(biāo)［4-5］。本文討論BC中涉及的異常的循環(huán)血液中非編碼RNA，及其在BC診斷中的應(yīng)用和研究進(jìn)展。

1 非編碼RNA

RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括信使RNA和非編碼RNA，非編碼RNA顧名思義即不編碼蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，非編碼RNA被分為兩個(gè)主要類別：短鏈非編碼RNA（＜200 bp）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs，＞ 200 bp）。mircoRNAs是短鏈非編碼RNA（ncRNA）序列，長(zhǎng)度為20-22 bp，在健康和疾病方面都具有重要的調(diào)節(jié)功能。lncRNAs由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，經(jīng)多聚腺苷酸化，并進(jìn)行了剪接，人體外周血中的RNA包含存在于細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外膜性小泡、細(xì)胞微泡和外泌體以及無(wú)細(xì)胞的核糖核蛋白中的，外周血中的循環(huán)mRNA與非編碼RNA被內(nèi)化而具有調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中重要途徑的能力［6］。

外泌體是由30～120 nm的小細(xì)胞衍生的囊泡，存在于許多生物的體液中。在20世紀(jì)80年代中期由JOHNSTONE小組首次發(fā)現(xiàn)［7］，腫瘤細(xì)胞外泌體作為信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)水平轉(zhuǎn)移生物活性因子，如蛋白質(zhì)、RNA和DNA，調(diào)節(jié)局部和全身的腫瘤微環(huán)境［8］。值得注意的是，據(jù)報(bào)道RNA是腫瘤細(xì)胞衍生外泌體的主要分子貨物，并且許多種類的非編碼RNA包括microRNA、環(huán)狀RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA也在這些外泌體中，可以反映出失調(diào)的ncRNA在腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)［9-10］。外泌體ncRNA可以進(jìn)入血液或其他體液，而這些血漿/血清衍生的或以尿?yàn)樵吹耐饷隗wncRNA可作為人類癌癥早期診斷或預(yù)后的重要非侵襲性生物標(biāo)志物［11］。

2 microRNA在循環(huán)血液中檢測(cè)膀胱癌的可行性

2.1 microRNA在循環(huán)血液中的功能及其機(jī)制短鏈非編碼RNA（sncRNA）在人類和哺乳動(dòng)物的血液中循環(huán)，其中最豐富的類型之一是mircoRNA并且只有mircoRNA的功能夠被良好的描述。在組織和體液中發(fā)現(xiàn)不同表達(dá)的mircoRNA已經(jīng)變得越來(lái)越重要。腫瘤特異性的mircoRNA首先在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中發(fā)現(xiàn)，高水平的miR-21與改善無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)［12］。MITCHELL等［13］對(duì)前列腺癌患者的miR-141的研究表明，mircoRNA在人類血漿中不受內(nèi)源性RNase活性的影響，以一種非常穩(wěn)定的形式存在。腫瘤表達(dá)的mircoRNA的血清水平可以從健康控制群中區(qū)分出患有癌癥的病人，且具有很高的特異性和敏感性。LU等［16］研究證明了檢測(cè)人類癌癥組織中mircoRNA表達(dá)的可行性和實(shí)用性。他們發(fā)現(xiàn)，不同癌癥中，mircoRNA表達(dá)的多樣性非常高，并發(fā)現(xiàn)了大約200個(gè)mircoRNA足以對(duì)人類癌癥進(jìn)行分類［14］。TAM等［15］研究發(fā)現(xiàn)由于mircoRNA是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的管理者，它們與其他生物標(biāo)記是不同的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩膊∵^(guò)程中具有致病作用，而且不是疾病的副產(chǎn)品。mircoRNA參與BC進(jìn)展的一個(gè)可能的機(jī)制是，細(xì)胞可能會(huì)將含有mircoRNA的復(fù)合物釋放到血液、唾液、尿液和母乳等生物體液中［16］。這些復(fù)合物包括mircoRNA結(jié)合蛋白，如阿爾古蛋白（AGO）［17］和高密度脂蛋白（HDL）［18］，或包含mircoRNA的微泡［16］。當(dāng)血液循環(huán)時(shí)，它們可能會(huì)被遠(yuǎn)端細(xì)胞所接收，mircoRNA與Ago2結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），以完全或不完全的配對(duì)方式與目標(biāo)mRNA的3′未翻譯區(qū)域（3′UTR）結(jié)合，如果是完全配對(duì)目標(biāo)mRNA會(huì)被核酸內(nèi)切酶定位切開，如果是不完全配對(duì)目標(biāo)mRNA會(huì)被導(dǎo)向翻譯抑制［19］。根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，可能有超過(guò)60%的蛋白質(zhì)編碼基因受到microRNA的調(diào)控［20］。mircoRNA參與人體穩(wěn)態(tài)的維護(hù)，mircoRNA的異常表達(dá)與多種疾病有關(guān)，包括癌癥。microRNA已經(jīng)被證明可以穩(wěn)定的存在于癌癥患者的血液中［21］，LODES等［22］的研究證明，一毫升血清中即有足夠的mircoRNA來(lái)檢測(cè)mircoRNA的表達(dá)模式，而不需要擴(kuò)增技術(shù)，并且，還可以通過(guò)使用這些表達(dá)模式來(lái)正確區(qū)分正常和癌癥患者的樣本。綜上所述，循環(huán)血液中的mircoRNA作為癌癥的生物標(biāo)記是很有潛力的，因?yàn)檫@意味著一種非侵入性的、精確的癌癥檢測(cè)方法。

另外，也有研究發(fā)現(xiàn)mircoRNA存在于外泌體中，并與某些疾病有關(guān)。有研究指出，循環(huán)外泌體的mircoRNA的含量與它們的原發(fā)癌細(xì)胞相似，這表明外泌體mircoRNA具有用于癌癥診斷的潛力［23］。

2.2 循環(huán)血液中的microRNA與膀胱癌越來(lái)越多的證據(jù)表明，mircoRNA作為新的生物診斷標(biāo)志物具有很大的臨床應(yīng)用潛力，然而在尿液樣本中檢測(cè)單個(gè)mircoRNA并不會(huì)優(yōu)于目前的尿路細(xì)胞學(xué)測(cè)試，因?yàn)檫@種分析特異性較低［24］。因此，也許microRNA在循環(huán)血液中的檢測(cè)BC是更好的選擇。

2.2.1 miR-26b-5p和miR-144-5p與膀胱癌TOLLE等［25］使用Sanger數(shù)據(jù)庫(kù)v14中由754個(gè)人類microRNA組成的mircoRNA微陣列，分析了從4個(gè)控制群和患有淺表性和侵襲性膀胱癌患者中獲得的血液和尿液樣本。使用RTqPCR技術(shù)，6種不同表達(dá)的microRNA在對(duì)照組（20個(gè)血液，19個(gè)尿液樣本）和淺表性（18個(gè)血液，16個(gè)尿液樣本）或侵襲性（20個(gè)血液和尿液樣本）腫瘤的患者中得到驗(yàn)證。在血液中miR-26b-5p檢測(cè)膀胱癌有94%的特異性和65%的敏感性，因此miR-26b-5p能夠在血液中被檢測(cè)作為BC的標(biāo)志物。并發(fā)現(xiàn)血液樣本中侵襲性BC的新標(biāo)志物miR-144-5p。

2.2.2 miR-92a，miR-100和miR-143與膀胱癌MOTAWI等［26］收集了70個(gè)BC患者的的血樣和62個(gè)對(duì)照組血樣。用定量實(shí)時(shí)PCR方法測(cè)出三個(gè)目標(biāo)mircoRNA（miR-92a、miR-100和miR-143）的表達(dá)，其結(jié)果與臨床病理資料相關(guān)聯(lián)，并進(jìn)行了分析，在BC患者中，miR-92a、miR-100和miR-143的血漿水平明顯低于對(duì)照組，miR-92a的靈敏度和特異性值分別為97%和76%，其截止值為0 573；miR-100的敏感性和特異性值分別為90%和66%，其截止值為0 644；miR-143的靈敏度和特異性值分別為78%和93%，其截止值為0.164；這些發(fā)現(xiàn)表明，血漿miR-92a、miR-100和miR-143在臨床檢測(cè)中可能是一種新的循環(huán)生物標(biāo)志物。

2.2.3 miR-497和miR-663b與膀胱癌DU等［27］通過(guò)TLDA技術(shù)從BC患者和無(wú)癌癥對(duì)照組的全基因組血漿mircoRNA中篩選出8種不同表達(dá)的血漿mircoRNA，再通過(guò)兩個(gè)階段的驗(yàn)證確定了血漿miR-497和miR-663b。前者在血漿中顯著減少，而后者則增加。此外通過(guò)分析進(jìn)行評(píng)估表明，血漿miR-497和miR-663b具有相對(duì)較高的敏感性和特異性。這表明，miR-497和miR-663b可能是BC診斷的一種很有前途的非侵入生物標(biāo)記物，這是第一個(gè)系統(tǒng)地探索特定血漿microRNA的存在，作為中國(guó)人口中BC的早期診斷生物標(biāo)志物。

2.2.4 miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p與膀胱癌JIANG等［28］在0.899的接收操作特征曲線下，采用多變量logistic回歸模型，建立了6個(gè)可能用于診斷BC的mircoRNA實(shí)驗(yàn)對(duì)象（miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p）。這組mircoRNA對(duì)于Ta、T1、T2-T4對(duì)應(yīng)的敏感性分別為90.00、84.85和89.36%，顯著高于尿細(xì)胞學(xué)的13.33、30.30、44.68%。此外，Kaplan-Meier分析顯示，具有高miR-152表達(dá)水平和低miR-3187-3p表達(dá)水平的NMIBC的無(wú)復(fù)發(fā)生存率更低。在多變量Cox回歸分析中，miR-152與NMIBC的腫瘤復(fù)發(fā)獨(dú)立相關(guān)。結(jié)果表明，血清mircoRNA在診斷BC時(shí)可能具有重要的臨床價(jià)值，此外血清miR-152的表達(dá)水平可以提供關(guān)于NMIBC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的信息。

3 lncRNAs在循環(huán)血液中檢測(cè)膀胱癌的可行性

3.1 lncRNAs在循環(huán)血液中的功能及其作用機(jī)制長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）被定義為一種具有低蛋白編碼能力的轉(zhuǎn)錄體，它通過(guò)調(diào)節(jié)數(shù)個(gè)信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)或腫瘤抑制作用。異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA可在循環(huán)癌細(xì)胞和癌癥患者的血清和尿液中檢測(cè)到，并且它們?cè)诎┌Y的不同階段和各種組織中表現(xiàn)出特定的表達(dá)模式，因此長(zhǎng)鏈非編碼RNA可以作為癌癥檢測(cè)的有效生物［29］。另外，一些研究表明特定的外泌體lncRNAs的表達(dá)與癌癥的臨床病理特征相關(guān)，這可能是血液中的LncRNAs作為膀胱癌生物標(biāo)志物的重要機(jī)制［30］。

3.2 循環(huán)血液中的lncRNAs與膀胱癌

3.2.1 UCA1與膀胱癌人類尿路上皮癌相關(guān)因子1（UCA1）基因位于染色體19p13.12，有三個(gè)外顯子，并編碼兩個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。腫瘤內(nèi)缺氧被廣泛認(rèn)為是實(shí)體腫瘤最基本的微環(huán)境應(yīng)力之一，不利于腫瘤的快速擴(kuò)張。在這種嚴(yán)酷的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞重塑周圍的微環(huán)境，不僅是為了維持生存和最佳生長(zhǎng)，而且也促進(jìn)了其隨后的入侵和傳播［31］。為了適應(yīng)缺氧微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞也可以刺激外泌體分泌或調(diào)節(jié)外泌體的含量，從而加速腫瘤轉(zhuǎn)移到更適宜的環(huán)境［32］。XUE等［33］研究發(fā)現(xiàn)缺氧的腫瘤細(xì)胞外泌體能夠分泌UCA1在血清中進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和入侵。另外，不僅在膀胱癌細(xì)胞中，在膀胱癌細(xì)胞衍生的外泌體中，缺氧都能夠誘導(dǎo)了lncRNA-UCA1上調(diào)。這表明低氧介導(dǎo)的lncRNA-UCA1轉(zhuǎn)移到膀胱癌外泌體中的機(jī)制可能依賴于缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)lncRNA-UCA1的上調(diào)。因此，證明缺氧可以調(diào)節(jié)膀胱癌衍生外泌體的內(nèi)容物的含量。外泌體為lncRNA-UCA1提供了一種保護(hù)膜，以對(duì)抗RNase降解，這保證了UCA1能夠在血漿、血清、尿液和其他體液中被檢測(cè)到。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與這些相一致，與正常的受試者相比，膀胱癌患者血清中的外泌體lncRNA-UCA1水平更高。因此UCA1很可能成為BC潛在的的診斷生物標(biāo)志物。在有侵襲性和晚期膀胱癌的患者中，化療是一種合理的選擇。然而，膀胱癌細(xì)胞往往會(huì)對(duì)這些療法產(chǎn)生耐藥性，約50%的晚期膀胱癌患者對(duì)化療沒(méi)有反應(yīng)。一些研究表明，lncRNA參與了化療抵抗的發(fā)展。FAN等［34］研究發(fā)現(xiàn)UCA1的水平在順鉑治療后的膀胱癌患者血液中顯著上調(diào)。其機(jī)制可能是上調(diào)的UCA1增加Wnt6表達(dá)并激活Wnt信號(hào)，導(dǎo)致順鉑受到抵抗。最終證明UCA1增加了膀胱癌細(xì)胞的順鉑耐藥，從而成為克服膀胱癌化療耐藥的潛在靶點(diǎn)。

3.2.2 MEG3、SNHG16和MALAT1與膀胱癌DUAN等［35］研究了80名BC患者13個(gè)候選LncRNAs的表達(dá)并通過(guò)定量的實(shí)時(shí)PCR與鄰近的正常組織相匹配。然后分析了240個(gè)血清樣本（訓(xùn)練集）和3個(gè)lncRNAs（MEG3、SNHG16和MALAT1）的差異表達(dá)。利用訓(xùn)練集建立了一個(gè)邏輯回歸模型，并在一個(gè)獨(dú)立的200個(gè)血清樣本（驗(yàn)證集）中進(jìn)行驗(yàn)證。由于在惡性腫瘤的起始和發(fā)展過(guò)程中復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，單一的lncRNA作為生物標(biāo)志物對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤可能不夠可靠。他們?cè)谘逯薪⒁粋€(gè)lncRNA小組（MEG3、SNHG16和MALAT1）以改善腫瘤的診斷性能。通過(guò)ROC分析，以評(píng)估lncRNA小組的診斷性能，結(jié)果表明循環(huán)的lncRNA小組可以區(qū)分BC患者和對(duì)照組，并且具有比尿細(xì)胞學(xué)更好的診斷性能。lncRNA小組對(duì)檢測(cè)Ta和T1腫瘤的敏感度也較高，分別顯示了73.1%和80.0%的檢測(cè)靈敏度，而尿液細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)靈敏度僅為11.5%和22.9%。這些結(jié)果表明，lncRNA小組可能是對(duì)BC診斷的潛在的侵入性最小的生物標(biāo)記，特別是在早期階段。此外，在這三種lncRNAs中，通過(guò)Kaplan-Meier分析確定了血清MEG3的表達(dá)減少明顯與NMIBC的RFS較差有關(guān)。此外，還通過(guò)單變量和多變量分析確認(rèn)血清MEG3是在NMIBC的RFS的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。這些結(jié)果表明，MEG3是NMIBC復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。KOHLS等［36］也對(duì)血清中MALAT1對(duì)于膀胱癌檢測(cè)的可行性進(jìn)行了研究，他們通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的方法對(duì)MALAT1進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，盡管MALAT1的水平經(jīng)常略高于檢測(cè)極限，但無(wú)細(xì)胞血清RNA的量化是可行的。但與非惡性疾病患者相比，膀胱癌患者的血清MALAT1水平并沒(méi)有顯著增加。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

迄今為止，固然腫瘤相關(guān)ncRNA進(jìn)入入人體外周血形成循環(huán)血液中的RNA以及它們?cè)谘褐械拇嬖谛问竭€未徹底確定，但循環(huán)血液中的ncRNA在臨床上的利用價(jià)值正在逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。隨著越來(lái)越多的對(duì)這一領(lǐng)域感興趣的研究者投身到ncRNA與BC的研究領(lǐng)域中，各種非編碼RNA作用機(jī)制的多樣和龐雜逐漸浮出水面，因此現(xiàn)在對(duì)于ncRNA功能的認(rèn)識(shí)仍然只是九牛一毛。非編碼RNA不僅可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，在身體的其他部位也可以，這成為目前研究的另一個(gè)途徑即血清、血漿和其他體液中循環(huán)的非編碼RNA。非編碼RNA在血液中的存在可能是癌癥中非侵入性生物標(biāo)記的金礦。