張中群 ，張 競(jìng) ，劉永彬 ，王 彧 ，柴 欣

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果實(shí)，具有強(qiáng)壯、補(bǔ)益、補(bǔ)腎壯陽(yáng)的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明覆盆子具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗腫瘤等活性，其主要含有黃酮類、萜類、甾體類、酚酸類等化合物[2]。

Thermal Shift Assay是近年新發(fā)展的一種基于熒光技術(shù)的快速檢測(cè)方法[3]，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)蛋白熒光染料（如Sypro Orange）的熒光信號(hào)觀察蛋白的熱穩(wěn)定性[4]。Protein Thermal Shift方法不僅可以快速測(cè)定蛋白熱穩(wěn)定性，還可以作為一個(gè)高效的篩選工具[5]，篩選對(duì)蛋白有作用的配體化合物。不同配體對(duì)蛋白熱穩(wěn)定性的影響不同，有的提高蛋白熱穩(wěn)定性，有的則降低蛋白熱穩(wěn)定性[6]，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)觀察蛋白的熔解溫度（Tm）判斷配體化合物對(duì)蛋白的作用強(qiáng)弱。

覆盆子具有抗骨質(zhì)疏松作用[7]，與其化學(xué)成分的雌激素樣活性相關(guān)[8-9]，研究表明覆盆子的乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的雌激素樣作用，顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖[10]。本研究采用Thermal Shift高通量篩選方法，對(duì)覆盆子中的10個(gè)主要化學(xué)成分（覆盆子酸、山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、異槲皮苷、金絲桃苷和短葉蘇木酚酸）進(jìn)行篩選。

1 材料

1.1 質(zhì)粒與菌株 pET-32a、pET-28a由南開大學(xué)郭宇副教授課題組惠贈(zèng)；DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。優(yōu)化的hERα、hERβ基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并構(gòu)建至pUC-57載體中。

1.2 藥物與試劑 覆盆子酸、山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、異槲皮苷、金絲桃苷和短葉蘇木酚酸為本實(shí)驗(yàn)室自制；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Sal I、BamH I、Nde I限制性核酸內(nèi)切酶為Thermo公司產(chǎn)品；LB Broth、氯化鈉、甘油、咪唑、氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG、Tris、Heps購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；Ni-NTA純化介質(zhì)，Hi-Trap Heparin柱購(gòu)自GE Healthcare；雌二醇（E2）、SYPRO?Orange Protein Gel Stain dye購(gòu)自Sigma Aldrich。

1.3 儀器 高壓破菌機(jī)（JNBIO，中國(guó)）；AKTA Explore蛋白純化系統(tǒng)（GE Healthcare）；Real-Time PCR（LightCycler?480,羅氏）。

2 方法

2.1 hERα-LBD、hERβ-LBD基因擴(kuò)增 采用primer引物設(shè)計(jì)軟件，通過(guò)編碼hERα-LBD、hERβ-LBD的基因序列設(shè)計(jì) hERα－LBD、hERβ－LBD 擴(kuò)增的上、下游引物。hERα－LBD（上游引物：5'－GCGGATCCAAGAAAAACAGCCTGGC－3'，下游引物：5'－TTGTCGACTTACGGTGCATGTAAACGGTGT－3）和hERβ－LBD（上游引物：5'－TTCATATGATGGATATCAAGAATAGCCCG－3'，下游引物：5'－ATGGATCCTTACTGACTCTGCGGATTCTG－3'）。以人工合成的 hERα、hERβ全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增hERα－LBD、hERβ－LBD基因片段。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性 50 s，58℃退火 50 s，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。將pET32a質(zhì)粒和hERα－LBD擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamHⅠ和SaLⅠ雙酶切；pET28a質(zhì)粒和hERβ－LBD擴(kuò)增產(chǎn)物分別用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收基因和質(zhì)粒。將基因與載體連接轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定為陽(yáng)性克隆后測(cè)序驗(yàn)證插入序列的完整性和正確性。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 取兩支100 μL BL21（DE3）商業(yè)感受態(tài)細(xì)胞，分別加入1 μL pET32a、pET28a重組質(zhì)粒，冰浴30 min，42℃熱激90 s，再次冰浴6 min，隨后轉(zhuǎn)入1 mL無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1 h使細(xì)胞復(fù)蘇，取200 μL涂固體LB平板，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

2.4 hERα－LBD、hERβ－LBD 重組蛋白的表達(dá)純化 將 hERα－LBD 或 hERβ－LBD BL21（DE3）陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到5 mL帶有抗性的LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素或50 μg/mL卡那霉素）培養(yǎng)5h，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)600nm檢測(cè)，當(dāng)吸光度A值為0.6時(shí)轉(zhuǎn)入800 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素或50 μg/mL卡那霉素）中37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。當(dāng)600 nm的吸光度A值為0.6時(shí)，降溫至16℃然后加入0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。4 000 g，4℃條件下，離心15 min倒掉上清液，加入適量體積的裂解緩沖液（hERα－LBD：20 mmol/L Hepes、300 mmol/L NaCl、10%甘油、pH 7.5；hERβ－LBD：20 mmol/L Tris－HCl、300 mmol/L NaCl、10%甘油、pH 8.5）振蕩重懸收集細(xì)胞。收集后的細(xì)胞采用高壓破菌機(jī)4℃循環(huán)破碎，25 000 g離心30 min，取上清液。采用預(yù)處理的Ni－NTA親和層析柱處理上清液，裂解緩沖液（含50 mmol/L咪唑）去除雜質(zhì)蛋白，含500 mmol/L咪唑的裂解緩沖液洗脫目的蛋白。目的蛋白濃縮后，4℃條件下10 000 g離心10 min，取上清液，采用AKTAExploer層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化。hERα－LBD 流動(dòng)相為（緩沖液 A：20 mmol/L Hepes、50 mmol/L NaCl、5%甘油，pH 7.5，緩沖液 B：20 mmol/L Hepes、1 mol/L NaCl、5%甘油，pH 7.5）；hERβ－LBD 流動(dòng)相為（緩沖液 A：20 mmol/L Tris－HCl、50 mmol/L NaCl、5%甘油，pH 8.5，緩沖液 B：20 mmol/L Tris－HCl、1 mol/L NaCl、5%甘油，pH 8.5）。收集純化后的流分并取樣用于SDS－PAGE分析。

2.5 Thermal Shift Assays 候選化合物覆盆子酸、山柰酚、山柰酚－3－O－蕓香糖苷、山柰酚－3－O－葡萄糖苷、山柰酚－3－O－洋槐糖苷、槲皮素－3－O－洋槐糖苷、蘆丁、異槲皮苷、金絲桃苷、短葉蘇木酚酸以及陽(yáng)性對(duì)照E2分別用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mmol/L 的母液，備用。hERα－LBD、hERβ－LBD、Sypro Orange、候選化合物分別用相應(yīng)的儲(chǔ)存緩沖液（hERα－LBD測(cè)試體系：含20mmol/LHepes，300mmol/L NaCl，pH 7.5；hERβ－LBD 測(cè)試體系：含 20 mmol/L Tris－HCl，300 mmol/L NaCl，pH 8.5）稀釋，分別將兩個(gè)蛋白稀釋至10 μmol/L，化合物稀釋至100 μmol/L。候選化合物與蛋白溶液以1∶1（v/v）混勻后加入96孔板中，每孔20 μL，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，冰上孵育30 min，避光加入稀釋后的 Sypro Orange1 μL（商品母液稀釋1000倍），封膜，在4℃條件下1000 g，離心2 min使孔內(nèi)無(wú)氣泡。以E2為陽(yáng)性對(duì)照，以含蛋白的緩沖液的為陰性對(duì)照，以儲(chǔ)存緩沖液為空白對(duì)照。采用 Real－Time PCR－LightCycler?480 系統(tǒng)通過(guò)連續(xù)測(cè)定20～95℃過(guò)程中SYPRO Orange染料的熒光強(qiáng)度變化從而監(jiān)測(cè)蛋白的去折疊過(guò)程。采用LightCycler?480 軟件（V1.5.0，Roche）擬合熔解曲線、計(jì)算蛋白熔化溫度（Tm）。

3 結(jié)果

3.1 hERα－LBD、hERβ－LBD 重組蛋白 SDS－PAGE蛋白經(jīng)AKTA Exploer層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化，收集流分，每500 μL為一個(gè)流分，采用SDS－PAGE對(duì)hERα－LBD、hERβ－LBD 重組蛋白進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖1所示。

由圖 1可見(jiàn) hERα－LBD、hERβ－LBD 大小與目的蛋白一致且純度均在95%以上，可用于進(jìn)一步配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。合并流分用30 kD超濾離心管濃縮并換液到儲(chǔ)存緩沖液中，Nanodrop2000測(cè)得hERα－LBD的濃度為 6 mg/mL，hERβ－LBD的濃度為3.5 mg/mL，液氮瞬間冷凍，－80℃保存。

圖1 hERα-LBD(A)、hERα-LBD(B)的SDS-PAGE結(jié)果（M：Marker）Fig.1 SDS-PAGE results of hERα-LBD(A)and hERα-LBD(B)(M:Marker)

3.2 候選化合物對(duì)受體蛋白熱穩(wěn)定性的影響 蛋白隨溫度升高會(huì)發(fā)生解鏈從而暴露出疏水性氨基酸，利用這一特性，可以特異性的添加一些僅與暴露的疏水性氨基酸結(jié)合的蛋白熒光染料，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)即可觀察蛋白的熱穩(wěn)定性狀況。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)PCR－LightCycler480系統(tǒng)檢測(cè)到的蛋白熔解熒光信號(hào)隨溫度的實(shí)時(shí)變化，結(jié)合候選化合物對(duì)hERα－LBD 或 hERα－LBD 的 Thermal Shift圖像，計(jì)算出候選化合物對(duì)hERα－LBD或hERα－LBD的熔化溫度變化（ΔT）。以ΔT為指標(biāo)篩選具有作用的配體化合物，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)ΔT＞2時(shí)為對(duì)受體蛋白具有作用的配體化合物[6]。

圖2 候選化合物對(duì)hERα-LBD、hERβ-LBD熔解溫度的影響Fig.2 Effects of candidate compounds on melting temperature of hERα-LBD and hERβ-LBD

由圖2所示，E2顯著提高了兩種雌激素受體配體結(jié)合域（hERα－LBD、hERβ－LBD）的熱穩(wěn)定性；在候選化合物中山柰酚能明顯提高h(yuǎn)ERα－LBD和hERβ－LBD的熔解溫度（ΔT＞2），尤其對(duì)hERβ－LBD的作用較顯著。山柰酚作用于兩種雌激素受體亞型配體結(jié)合域的實(shí)時(shí)熔解曲線如圖3所示。

圖3 山柰酚對(duì)hERα-LBD（A）、hERβ-LBD（B）熔解溫度的影響Fig.3 Effects of Kaempferol on melting temperature of hERα-LBD(A)and hERβ-LBD(B)

4 討論

雌激素為甾體類化合物，具有廣泛的生物活性，不僅在女性生殖器官的發(fā)育、第二性征的維持中起著重要的作用，而且對(duì)骨質(zhì)代謝、脂類代謝、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等也有重要的作用[11－13]。雌激素的經(jīng)典作用機(jī)制認(rèn)為，雌激素首先與雌激素受體上的配體結(jié)合區(qū)合并使受體二聚化，進(jìn)一步使雌激素受體的DNA結(jié)合區(qū)（DBD）與靶基因啟動(dòng)子上的雌激素應(yīng)答元件（ERE）結(jié)合，從而啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[14－15]。雌激素可用于治療絕經(jīng)期女性心血管疾病、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等疾病，因此激素替代治療（HRT）廣泛應(yīng)用于臨床。然而HRT是把雙刃劍，帶來(lái)改善的同時(shí)也帶來(lái)不少的毒副作用，如：子宮內(nèi)膜出血、乳房脹痛，增加中風(fēng)、靜脈血栓、乳腺腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤等的發(fā)生率[16－17]。植物雌激素（PE）是一類從天然植物中提取，結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素相似的一類化合物，能夠模擬雌激素在人體內(nèi)的理化作用，與雌激素受體的兩種亞型均可結(jié)合并將其激活[18－20]，但親和力相對(duì)較弱。植物雌激素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、腫瘤、心血管疾病、老年性癡呆癥等疾病有獨(dú)特的預(yù)防和治療功效，同時(shí)比雌激素有更多優(yōu)點(diǎn)[21]。植物雌激素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要分為4大類：黃酮類、香豆素類、木脂素類以及二苯乙烯類[22－23]。

黃酮類化合物是覆盆子代謝過(guò)程中產(chǎn)生的重要天然有機(jī)化合物，是覆盆子中主要活性成分之一，山柰酚屬于黃酮類化合物，具有、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效[24]。本研究基于雌激素受體與配體結(jié)合發(fā)揮作用的機(jī)制，采用高通量篩選方法篩選覆盆子中的植物雌激素，操作簡(jiǎn)單，為篩選中藥中雌激素樣活性化合物或者其它可通過(guò)與靶蛋白結(jié)合發(fā)揮作用的活性化合物提供了一個(gè)高效、快速的研究方法。

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