白如冰 張忠泉 岑 娟

河南大學(xué)天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南大學(xué)藥學(xué)院，開封，475004，中國

1 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的簡介

P-gp是一種由1 280個(gè)氨基酸組成，分子量為170 KD的跨膜糖蛋白，屬于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）依賴型（ATP-binding-cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族一員［1］。P-gp廣泛存在于生物體的正常組織中，尤其在具有生理屏障和分泌功能的組織和器官中呈高表達(dá)狀態(tài)，P-gp是血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的重要組成部分［2］。P-gp 是一種能量依賴性藥物外排泵，當(dāng)外來物質(zhì)或者細(xì)胞代謝物進(jìn)入細(xì)胞后，P-gp與外來物質(zhì)結(jié)合的同時(shí)也與ATP結(jié)合，利用ATP水解釋放的能量將其泵出細(xì)胞，從而維持細(xì)胞內(nèi)正常濃度，限制有害物質(zhì)在腦內(nèi)滯留。這既是機(jī)體生理狀態(tài)下的自我防御保護(hù)，也是導(dǎo)致腦內(nèi)藥物濃度降低，引起多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的主要原因之一［3］。近年來，隨著科學(xué)研究的發(fā)展，越來越多的研究表明P-gp在癲癇、腦缺血、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病和治療中擔(dān)任重要角色［4］。而藥物干預(yù)也往往從P-gp入手，通過靶向制劑使藥物選擇性的集中在病灶區(qū)域，增加藥物的濃度，降低毒副作用［5］。

2 P-gp在神經(jīng)元中的表達(dá)

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，有接受、傳遞和整合信息的功能。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病最明顯的病理變化就是神經(jīng)元的損傷與凋亡。如：癲癇患者最顯著的病理變化是病灶區(qū)神經(jīng)元的異常放電［6］；AD主要病理特征為神經(jīng)元外β-淀粉樣蛋白（amyloid-β protein，Aβ）聚集形成老年斑、神經(jīng)元內(nèi)的tau蛋白異常磷酸化聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)和相關(guān)腦區(qū)突觸及神經(jīng)元丟失［7］；PD表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失等［8］。在腦內(nèi)，P-gp主要分布在微血管的內(nèi)皮細(xì)胞膜和脈絡(luò)叢的上皮細(xì)胞表面［9］。生理情況下，P-gp主要表達(dá)在BBB毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，而在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上不存在表達(dá)［10］。但是有研究表明，在一些疾病狀態(tài)下，P-gp在神經(jīng)元上也存在表達(dá)現(xiàn)象［11］。

2.1 癲癇

癲癇狀態(tài)下，P-gp不僅在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，而且在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中均出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象［12］。丁寧等［13］在海人酸（kainate，KA）致癲癇的大鼠海馬區(qū)觀察到神經(jīng)元部分丟失，排列疏松，胞體皺縮，形態(tài)不規(guī)則。Western-blot結(jié)果顯示，KA致癲組海馬區(qū)P-gp表達(dá)與對照組相比明顯增多。在毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中，癲癇狀態(tài)持續(xù)24 h后，除了內(nèi)皮細(xì)胞P-gp表達(dá)外，腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)元上也出現(xiàn)P-gp的表達(dá)［14］。在 3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，3-MPA）誘導(dǎo)大鼠癲癇反復(fù)發(fā)作，免疫組織化學(xué)法觀察到，除了在血管中表達(dá)P-gp，在大鼠的海馬、紋狀體也檢測到P-gp的熒光染色［15］。以上結(jié)果提示，癲癇發(fā)作后，腦內(nèi)P-gp的表達(dá)主要集中在海馬部位，在內(nèi)皮細(xì)胞上顯著表達(dá)的同時(shí)，在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞上也存在過表達(dá) 。大量動物模型以及人腦組織研究表明P-gp的過度表達(dá)與難治性癲癇的多藥耐藥性呈正相關(guān)。

2.2 腦缺血/再灌注損傷

目前，P-gp在腦內(nèi)表達(dá)的研究主要集中在內(nèi)皮細(xì)胞上。大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型中，大鼠腦缺血再灌注90 min后，內(nèi)皮細(xì)胞上P-gp就出現(xiàn)過表達(dá)［16］。MCAO缺血再灌注模型中，大鼠缺血再灌注2 h后，可見BBB處血管內(nèi)皮細(xì)胞上P-gp表達(dá)升高，在缺血損傷側(cè)皮質(zhì)、紋狀體的血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元上也出現(xiàn)了P-gp的陽性表達(dá)［17］。不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯?shí)驗(yàn)方法研究腦缺血后P-gp的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)缺血后P-gp在神經(jīng)元細(xì)胞上有表達(dá)［18］。

2.3 神經(jīng)退行性疾病

Aβ沉積是導(dǎo)致AD的主要因素，有效減少Aβ在腦內(nèi)的沉積是最有效的治療途徑之一［19］。有實(shí)驗(yàn)［20］發(fā)現(xiàn)利伐斯的明通過上調(diào)P-gp和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白，增加其在BBB上的清除能力，從而降低了老年大鼠的Aβ。這證明了P-gp對Aβ有外排作用。同時(shí)有研究表明在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，P-gp蛋白水平降低，恢復(fù)P-gp的表達(dá)能有效減少Aβ的積聚［21］。有研究報(bào)道［22］在AD患者腦內(nèi)組織的海馬區(qū)微血管內(nèi)皮上P-gp的表達(dá)顯著低于正常水平。周麗等［23］用新生海馬腦片培養(yǎng)技術(shù)，用Aβ誘導(dǎo)建立AD模型，經(jīng)免疫組織化學(xué)方法觀察到海馬腦片組織中神經(jīng)元受損，數(shù)目減少。在百草枯誘導(dǎo)的PD模型中發(fā)現(xiàn)，模型組腦內(nèi)黑質(zhì)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，P-gp顯著降低，而且P-gp隨著時(shí)間的增多逐漸降低，與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)作用［24］。這有可能是低表達(dá)的P-gp影響了腦內(nèi)神經(jīng)毒性物質(zhì)的外排，增加了致病因素。

3 氧化應(yīng)激影響P-gp的表達(dá)

3.1 氧化應(yīng)激對P-gp的影響

在細(xì)胞新陳代謝過程以及對環(huán)境刺激時(shí)，好氧生物體中的氧都會不斷產(chǎn)生活性氧反應(yīng)物（reactive oxygen species，ROS）。他們是由不完全的單電子還原形成的小分子或離子，包括自由基，如：超氧陰離子（O2·-），羥基自由基（OH·），過氧烷基自由基（RO2·）和烷氧自由基（RO·），以及氧化劑或者易于轉(zhuǎn)化為自由基的非自由基物質(zhì)，如過氧化氫（H2O2），次亞氯酸（HOCl），臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2）等。氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是指機(jī)體的氧化與抗氧化平衡失調(diào)，且表現(xiàn)偏向于氧化的形態(tài)。機(jī)體在受到缺血、缺氧、中毒等外界刺激時(shí)，體內(nèi)的ROS可大量產(chǎn)生，從而使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)并且導(dǎo)致許多疾病、發(fā)育異常和衰老，如癲癇、癡呆、腦缺血/再灌注損傷、動脈粥樣硬化等。研究發(fā)現(xiàn)ROS和P-gp的表達(dá)有著密切的聯(lián)系。D-P40細(xì)胞用H2O2處理后P-gp表達(dá)增加，加入抗氧化劑后P-gp表達(dá)下降，說明氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)［25］。許多實(shí)驗(yàn)表明ROS調(diào)控P-gp與許多信號分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，如核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、PI3K/AKT 信號通路、活化分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）信號通路等。

Nrf2是CNC亞家族轉(zhuǎn)錄因子的成員，最初通過與抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合而被認(rèn)為是II期解毒和抗氧化基因的主要調(diào)節(jié)因子［26］。許多基因（包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族）作為MDR的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，受Nrf2依賴性信號調(diào)節(jié)。Jeddi F［27］等人發(fā)現(xiàn)在胃癌患者樣本中Nrf2的表達(dá)顯著增高，同時(shí)P-gp表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用Nrf2表達(dá)性抑制劑可以顯著下調(diào)P-gp的表達(dá)，證明Nrf2和P-gp之間存在關(guān)聯(lián)性。

PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路是細(xì)胞響應(yīng)胞外生存和生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。許多研究表明在腫瘤細(xì)胞中，ROS持續(xù)生成主要激活PI3K/AKT信號通路，并進(jìn)一步促進(jìn)癌癥的發(fā)展［28］。目前已報(bào)道P-gp介導(dǎo)的MDR在腫瘤化療失敗中起關(guān)鍵作用，并且在不同類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了PI3K/AKT細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，與多種惡性腫瘤的P-gp表達(dá)相關(guān)。本課題組［29］研究發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7用H2O2作用20周后，細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)增多，細(xì)胞耐藥性增加，使用特異性PI3K抑制劑LY294002可以顯著降低ROS誘導(dǎo)的P-gp表達(dá)水平。Zhang B［30］等人通過研究甲烷對腦缺血再灌注的研究發(fā)現(xiàn)，甲烷可以顯著降低MDR的水平，主要是增加了AKT磷酸化的表達(dá)。使用PI3K抑制劑和AKT抑制劑后，甲烷對ROS引起的神經(jīng)損傷保護(hù)作用顯著降低。這說明甲烷可能是用過激活PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路降低ROS引起的MDR的表達(dá)。

MAPK家族是重要的信號調(diào)節(jié)激酶，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、有絲分裂、炎癥反應(yīng)等影響細(xì)胞的生長和死亡。MAPK參與了P-gp的表達(dá)，當(dāng)使用特異性MAPK抑制劑阻斷MAPK信號通路時(shí)，P-gp的表達(dá)也會降低［31］。MAPK家族主要有ERK1/2、JNK、和P38。多種生長因子受體、營養(yǎng)相關(guān)因子受體等都需要ERK1/2的活化來完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。有研究表明磷酸化的ERK1/2在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)，并且在缺血損傷側(cè)半暗帶的呈高表達(dá)狀態(tài)，這表明ROS影響ERK1/2的表達(dá)。此外，由于ROS不僅是氧化應(yīng)激的損傷分子，更參與了機(jī)體的正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究表明當(dāng)今針對腦缺血的抗氧化治療臨床效果的局限性也可能與其對ROS的粗放干預(yù)有關(guān)，ROS的過量降低可能導(dǎo)致P-gp的表達(dá)增加，更不利于神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)入腦區(qū)發(fā)揮作用［32-34］。

PKC是一種細(xì)胞質(zhì)酶，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，呈非活性構(gòu)象，在第二信使的存在下，PKC將成為膜結(jié)合的酶，從而激活細(xì)胞質(zhì)的酶，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時(shí)PKC也作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞信號的傳遞、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、基因的表達(dá)等等。有研究表明ROS的某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是通過PKC的激活實(shí)現(xiàn)的，PKC同時(shí)也參與了MDR的調(diào)節(jié)。本課題組［29］研究發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7用H2O2作用20周后，細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)增多，細(xì)胞耐藥性增加，PKC信號通路被激活。

3.2 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子對P-gp的影響

大量的研究顯示，氧化應(yīng)激誘發(fā)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生。已知在中風(fēng)急性期（數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)），腦實(shí)質(zhì)中釋放的促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或白細(xì)胞介素 -1 β（interleukin-1 β，IL-1 β）會誘導(dǎo)血管滲透性，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的過度表達(dá)和活性。因此，炎癥反應(yīng)加劇了BBB的破壞并且惡化了神經(jīng)血管損傷［35］。Huang L［36］等人通過建立MCAO/再灌注模型，測定炎性細(xì)胞因子，包括 TNF-α，IL-1β和 IL-6，發(fā)現(xiàn)上述因子濃度增加，表明MCAO/再灌注損傷后氧化應(yīng)激誘發(fā)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生。維拉帕米是P-gp的底物，可以穿過血腦屏障反映P-gp的功能［17］。實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS系統(tǒng)測定腦組織中維拉帕米濃度，發(fā)現(xiàn)P-gp的濃度顯著增加，表明炎癥對 P-gp 的表達(dá)產(chǎn)生影響，TNF-α、IL-1 β、IL-6 等炎癥因子可以通過某些機(jī)制調(diào)節(jié)P-gp的表達(dá)。核因子-κ B（nuclear factor κ B，NF-κ B）是參與基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，參與炎癥反應(yīng)，調(diào)控多種基因的表達(dá)。NF-κ B活化可以上調(diào)P-gp的表達(dá)［37］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κ B可以降低P-gp的表達(dá)，其機(jī)制主要為MDR1基因啟動子區(qū)存在NF-κ B亞基p65結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)［38］。

3.3 其他因素對P-gp的影響

研究表明很多細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子也參與P-gp的表達(dá)，如：缺氧誘導(dǎo)因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）。HIF-1α在腦缺血缺氧狀態(tài)下表達(dá)增高。與多研究表明HIF-1α可調(diào)控MDR1基因的表達(dá)，誘導(dǎo) P-gp的表達(dá)升高［39］。如 Tallis S 等［40］在模型組中觀察到皮質(zhì)神經(jīng)元中HIF-1α的高表達(dá)。這種類似缺氧的狀態(tài)可能是某些物質(zhì)通過占據(jù)HIF-1α結(jié)合結(jié)構(gòu)域引發(fā)的，從而阻止其降解并誘導(dǎo)其穩(wěn)定化，進(jìn)而導(dǎo)致P-gp過量表達(dá)。在腦缺血過程中，谷氨酸可在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)大量釋放或堆積，谷氨酸可以過度激活NMDA受體產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，從而活化環(huán)氧合酶 -2（cyclooxygenase-2，COX-2），上調(diào) P-gp 的表 達(dá)。有研究表明多柔比星誘導(dǎo)的MDR1上調(diào)可能依賴于COX-2轉(zhuǎn)錄活性而非PGE2，這表明COX-2與MDR1表達(dá)之間存在因果關(guān)系［41］。Yan Y X等人［42］的實(shí)驗(yàn)表明COX-2抑制劑塞來昔布可以顯著下調(diào)P-gp的表達(dá)和功能。還有研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽（glutathione，GSH）、熱休克蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）、高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB 1）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）［43-46］等，也可以改變P-gp的表達(dá)水平并且影響著其功能的正常發(fā)揮。

4 特異性調(diào)控P-gp的意義

P-gp作為一種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的過程是復(fù)雜的，確切的機(jī)制目前也尚未完全闡明?；赑-gp吸收能量外排藥物的特點(diǎn)、作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系等，至今發(fā)展到第三代P-gp抑制劑［47-48］。P-gp抑制劑主要作用是抑制P-gp的上調(diào)，從而增加治療藥物的濃度，達(dá)到預(yù)期的治療效果。然而P-gp在人體廣泛分布，例如肝臟、腎臟、腦、小腸和睪丸等多種器官均有表達(dá)，并各自發(fā)揮不同作用。對P-gp的非選擇性抑制反而會干擾正常屏障組織的功能，因此如何特異性抑制病理性增加的P-gp研究意義更大［49］。現(xiàn)在研究已經(jīng)證明P-gp在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、腦缺血時(shí)表達(dá)增高，導(dǎo)致治療藥物不能進(jìn)入腦內(nèi)，使這些疾病臨床療效不盡人意。但是在一些神經(jīng)退行性疾病如AD、PD中，P-gp的表達(dá)降低，不能有效的清除腦內(nèi)有害物質(zhì)，從而使有害物質(zhì)在腦內(nèi)蓄積，引發(fā)疾病。掌握腦內(nèi)不同細(xì)胞、不同狀態(tài)下P-gp的變化規(guī)律，在相應(yīng)的時(shí)間窗內(nèi)給予P-gp的抑制劑將會提高腦內(nèi)藥物濃度，從而提高藥物的治療作用［10］。探索P-gp表達(dá)影響因素、作用機(jī)制及尋找其有效的抑制劑，對其治療將具有重要意義，如PI3K/Akt信號通路各分子的抑制劑和NF-κB抑制劑現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。本課題組研究表明，ROS與多種神經(jīng)疾病及腫瘤耐藥息息相關(guān)，ROS作為第二信使激活了大量信號通路發(fā)揮著病理機(jī)制下的P-gp調(diào)控［50］。因此，關(guān)注ROS對P-gp的特異信號作用對揭示P-gp在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用、及其抑制劑開發(fā)等方面意義重大。