孫美娜，張凡凡，王永強,3，魏曉燕,4，魯建江

(1.石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色工程重點實驗室，新疆石河子 832000；2.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；3.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453000；4.武威市畜牧獸醫(yī)科學研究院，甘肅武威 733000)

0 引 言

【研究意義】棉花是重要的纖維作物和油料作物，其涉及農業(yè)和輕工業(yè)紡織等國家支柱產業(yè)[1]。新疆是我國最大的產棉區(qū)，而當地棉稈利用效率極低，雖其具有開發(fā)生物能源和建筑材料等的潛力，但在實際生產中還未得到充分應用[2,3]。目前，隨著新疆棉花種植區(qū)經濟條件的不斷完善，棉花秸稈作為燃料的使用量開始大幅減少，大量秸稈被閑置堆漚浪費或者直接焚毀，這樣不僅污染環(huán)境，且易造成棉田因有機肥力的下降，從而限制新疆棉花產業(yè)的快速發(fā)展。隨著當前科學技術的發(fā)展和人們環(huán)保意識的提高，將棉稈直接粉碎還田是合理有效利用資源的一條可行途徑[4]。但由于棉稈木質化程度比較高，在短時期內難以腐熟成肥，且在長期連作條件下，土壤中積累的腐解物對棉花的生長有著自毒化感效應。所以如何促進棉稈的快速腐解，消除其負面影響，是當前新疆棉花產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保證之一[5]?！厩叭搜芯窟M展】棉稈富含多種營養(yǎng)成分，可為發(fā)酵微生物提供良好的營養(yǎng)物質，但棉稈中纖維素、木質素等含量較高，且結構致密不易腐爛分解變成肥料[6]。所以有效利用微生物手段降解棉稈纖維是目前亟需解決的問題[5,7]。目前，自然界中存在的某些細菌、放線菌和真菌等均存在降解纖維素的特性，而其中放線菌和細菌產酶含量低，放線菌生長速度慢，且其二者多產生胞內酶，難于分離，因此不易大規(guī)模生產。所以在工業(yè)生產中，主要利用木霉菌(Trichoderma. sp)和曲霉菌(aspergillus. sp)生產纖維素酶[7,8]。研究表明，如革蓋菌屬(Coriolus.sp)、臥孔菌屬(Poria.sp)、原毛平革菌屬(Phanerochaete.sp)及煙管菌屬(Sjekandera.sp)等；另有青霉屬(Penicillium.sp)、枝頂孢霉屬(Acremonium.sp)、漆斑霉屬(Myrothecium.sp)、脈孢霉屬(Neurospora.sp)、毛殼霉屬(Chaetomium.sp)等菌株對纖維素也具有較高的纖維分解能力，這些菌株為降解秸稈提供了大量的菌株資源[7,9,10]?！颈狙芯壳腥朦c】由于棉稈表面附著大量真菌，且其中存在一定具有纖維降解能力的真菌，而目前對這些真菌的實際降解棉稈中纖維能力的研究不夠完善。研究利用微生物學和分子生物學手段篩選和鑒定棉稈表面附著的真菌。【擬解決的關鍵問題】研究利用微生物學和分子生物學手段篩選和鑒定棉稈表面附著的真菌，獲得具有高效纖維素分解能力的真菌，并對其進行了纖維素酶活性的分析，為進一步進行菌株的選育與改造，開展棉稈人工接種纖維素腐解菌劑研究及應用提供技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉稈

棉花秸稈樣品采自石河子大學農學院實驗基地。采集的棉花秸稈樣品(鮮樣)帶回實驗室粉碎，一份用作真菌的提取，另一份干燥(65℃，48 h)保藏。

1.1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z 上海博迅醫(yī)療設備廠)、電泳儀(PowerPac Universal 美國BioRad公司)、PCR擴增儀(TC-512 英國Techne公司)、電熱恒溫干燥箱(GZX-DH-50×55-S 上海躍進醫(yī)療器械廠)、高速冷凍離心機(Fresco 21 Thermo 公司)、潔凈工作臺(SW-CJ-01FD 上海博訊醫(yī)療)、立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KB 上海申安)、電子分析天平(AUY220 SHIMADZU)等；試劑主要為生工生物的真菌基因組DNA提取試劑盒、蝸牛酶、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、剛果紅培養(yǎng)基(CRA)、無機鹽瓊脂培養(yǎng)基(ISAM)、以及北京路橋的PCR回收純化試劑盒、T-載體PCR產物克隆試劑盒等。

1.2 方 法

將粉碎的棉花秸稈直接接種于PDA液體培養(yǎng)基中，有氧環(huán)境(28℃)培養(yǎng)7 d。平板劃線純化2次，將初步純化的菌種分別接種于以粉碎干燥棉稈(過200目篩)為唯一C源的ISAM固體培養(yǎng)基中，篩選可利用C源(具有降解棉稈纖維能力)的菌種，再挑選單一菌落于PDA液體培養(yǎng)基中擴繁，將擴繁后的菌種點接至加入粉碎干燥棉稈的剛果紅培養(yǎng)基中(CRA纖維素培養(yǎng)基)[11]，選取水解圈直徑較大菌種進行分子生物學鑒定[12]，并連續(xù)5 d(24、48、72、96、120 h)測定其濾紙酶活性(FPA)和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)糖化活力，具體方法同房興堂[13]、傅力[14]等的測定方法。其中FPA代表纖維素酶中多種酶系組分協同作用后的總酶活，CMC-Na主要代表β-1,4-葡聚糖的活力。將分析后的菌種分別接種至PDA液體培養(yǎng)中擴繁(28℃ 培養(yǎng)3 d)，將擴繁后的菌種分別接種于棉稈中(鮮樣)，接種量為10%，接種后連續(xù)觀測25 d，期間每5 d測定棉花秸稈(纖維)的失重率，反映各菌種對棉稈纖維的實際降解效果。其中纖維的測定采用范式(Van Soest)洗滌法[15]，失重率計算采用重量差減法：秸稈失重率% = (初始重量-接種菌種后重量)/ 初始重量×100%。

菌種分子生物鑒定：選用真菌通用引物對真菌26S rDNA的DD2區(qū)域進行PCR擴增[16]，擴增體系為50 μL∶2 μL模板DNA，2 μL上游引物(NL1)，2 μL下游引物(NL4)，PCR Mix預混液25 μL，dd H2O 19 μL。引物序列為，NL1：5’- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG -3’和NL4：5'- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'。PCR擴增程序：95℃預變性10 min，(95℃變性30 s，56℃褪火30 s，72℃延伸30 s)38個循環(huán)，最終72℃延伸10 min[17]。采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。切下明亮條帶進行回收、純化(采用PCR回收純化試劑盒)。連接T載體(采用T-載體PCR產物克隆試劑盒)后送至北京六合華大基因公司進行測序。測得的16S rDNA序列經過Genbank數據庫進行Blast。

1.3 數據處理

數據采用Excel 2007整理，采用SPSS 22.0軟件進行數據的F檢驗，當通過F檢驗后進行單因素(one- way ANOVA)方差分析，多重比較方法均采用Duncan法，差異性判斷方法為P<0.05時差異顯著，P>0.05時差異不顯著[18]。

Genbak中選取相關特征序列，與研究測序結果一起采用Clustal W按照最大同源性(各結果采用DNA star對比分析同源性)原則進行多重序列對比[19]，對比結果采用MEGA軟件建立系統發(fā)育樹。重復(Bootstrap)次數為1 000次[20]。

2 結果與分析

2.1 棉花秸稈降解菌的降解能力

根據透明圈直徑大小篩選出降解效果最為明顯的菌株，分別將其編號為SN-1、SN-2、SN-3、SN-4。4株降解菌的生長速率各不相同，CRA纖維素培養(yǎng)基中透明圈直徑大的菌株其生長速率較快，降解效果較好，按水解圈直徑按大小排序為，SN-1(3.48 cm)>SN-4(3.06 cm)>SN-3(2.38 cm)>SN-2(1.56 cm)(P=0.013，F=25.282)。圖14株纖維素降解菌的CMC-Na糖化酶活和FPA酶的活隨著培養(yǎng)時間的增加而上升，在培養(yǎng)24 h后CMC-Na酶活和FPA酶活呈快速上升的趨勢，72 h時，酶活力達到最高值。當培養(yǎng)時間超過72 h后，酶活力開始下降，4菌株CMC-Na酶活和FPA酶活變化趨勢基本一致。具體對于CMC-Na糖化酶活力，24～96 h時SN-1菌種均顯著低于其它3個菌種(P<0.05)，而在第120 h時，各菌種處理間差異不顯著(P>0.05)。對于FPA活性，在第24和120 h時SN-1和SN-4菌種顯著高于SN-2和SN-3菌種(P<0.05)；其它時間點，各菌種按活性高低排序為：SN-1、SN-4>SN-3>SN-2(P<0.05)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note: Different letters show significant difference in the figure (P<0.05). The same as below

圖1 4種菌種水解圈直徑
Fig.1 The hydrolytic circle diameter of 4 species (cm)

對4株菌種棉花秸稈的失重率測定，研究表明，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)第5、20和25 d各處理按棉花秸稈失重率高低排序為，SN-1、SN-4>SN-3>SN-2>CK(P<0.05)，第10和15 d排序為，SN-1、SN-4>SN-2、SN-3>CK(P<0.05)。表1

2.2 棉花秸稈降解菌菌落形態(tài)

降解菌菌落形態(tài)鑒定顯示，SN-1菌株菌落蔓延迅速，初為白色，后變成黑色厚絨狀，表面黑色，粉末狀，菌落生長快，經過乳酸-石碳酸染色后經過鏡檢可見，孢子梗頂端膨大成圓形或者是橢圓形，呈放射狀排列。SN-2菌落呈圓形，粉紅色的菌落，菌落表面為絨狀，菌絲緊密隆起，菌絲纖細為白色，較易形成分生孢子，經過乳酸-石碳酸染色后經過鏡檢可見，分生孢子單胞或雙胞，無色，橢圓形或長橢圓，大小不一，菌絲發(fā)達。SN-3菌落呈圓形，黑色的菌落，菌落表面為絨狀，菌絲疏松隆起，生長迅速，擴散快，經過乳酸-石碳酸染色后經過鏡檢可見，分生孢子卵形、橢圓形或倒棒形，淡欖褐色至褐色，平滑，多有短或長喙，串生。SN-4菌株表面為青色，菌落成片生長，氣生菌絲為白色，邊緣不規(guī)則，菌落中央隆起，經過乳酸-石碳酸染色后經過鏡檢可見，分生孢子梗的頂端并不膨大，有指狀分枝，且有可以再分的分枝[21]。圖2

表1 不同培養(yǎng)時間4種酶活性變化規(guī)律及棉花秸稈失重率
Table 1 The analyzed of cotton stalks on loss rate and 4 kinds of enzyme activity in different culture time

指標菌種Bacteria時間 Time24h48h72h96h120hCMC糖化酶活力CMCSaccharifyingenzymeactivity(U/mL)SN-14623±212a5438±282a5623±319a4918±178a4323±228aSN-23727±112b4233±222b4682±189b4392±278b4212±128aSN-34328±192a5282±261a5492±202a4978±218a4222±149aSN-44523±242a5133±358a5444±172a5002±222a4222±222aSEM437398374305201P值00120021002900300152濾紙酶活性Filterpaperenzymeactivity(U/mL)SN-12152±274a2831±322a3242±217a2738±119a2498±318aSN-21682±178b1779±272c2237±093c1792±192c1483±193bSN-31503±183b2102±191b2513±195b2319±208b1731±206bSN-41989±247a2682±258a3115±272a2732±222a2214±236aSEM281324317308284P值0018<001<001<0010011菌種Bacteria時間 Time5d10d15d20d25d棉花秸稈失重率Weightlessnessrateofcottonstalks(%)SN-11501±103a3006±112a4003±217a4924±213a5252±318aSN-2824±113c1898±093b2476±093b3288±098c3613±143cSN-31122±092b1898±091b2445±112b3981±208b4211±136bSN-41482±188a3234±233a4356±322a4678±312a4882±236aCK521±078d538±048c621±061c648±057d756±072dSEM274208304323381P值<001<001<001<001<001

注：左圖為各菌種鏡檢，右圖為培養(yǎng)基中菌落形態(tài)

Note: The left image is a microscopic of the bacteria. The right image is colony shape in medium

圖2 各降解菌株鏡檢及菌落形態(tài)
Fig.2 The microscopy and colony morphology of degrading bacteria strain

2.3 棉花秸稈降解菌株的鑒定

以NLl和NL4為通用引物特異擴增降解菌的26S rDNA，將得到的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后于紫外凝膠成像系統上觀察并拍照，電泳結果顯示PCR擴增產物均為單一的條帶，無非特異擴增現象，根據Marker分子量大小得到4株降解菌的序列片段大小長度均為600 bp左右。圖3

將基因序列提交NCBI檢索系統，通過BLAST工具在GenBank數據庫中基因序列進行同源性比對，以降解菌同源性最高的序列構建系統發(fā)育樹。26S rDNA區(qū)域序列比較分析構建了主要降解菌菌株系統發(fā)育樹。由系統發(fā)育樹可以看出SN-1菌株與黑曲霉(Aspergillusniger)親緣關系最近，基因序列同源性為99%。SN-2菌株與串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis)親緣關系最近，基因序列同源性為100%。SN-3菌株與交鏈孢霉(Alternarianees)親緣關系最近，基因序列同源性為100%。SN-4菌株青霉菌(penicillium)親緣關系最近，基因序列同源性為100%。圖4

圖3 各菌株PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測
Fig.3 The agarose gel electrophoresis test of PCR amplicon with all bacteria strain

圖4 4株菌種的系統發(fā)育樹
Fig.4 The phylogenetic tree of 4 bacteria strain

3 討 論

纖維素的有效降解已成為目前最為熱門的話題，國內外學者對此項工作均開展過相關研究。試驗采用纖維素初篩培養(yǎng)基及剛果紅復篩培養(yǎng)基，從棉田土壤中篩選出4株能產生纖維素降解透明水解圈的菌株，通過纖維素降解出現透明圈的大小及時間，可以作為菌株產纖維素酶活大小的初選指標，這在降解菌純培養(yǎng)纖維素酶活性測定及接種測定棉花秸稈的失重率結果均得到了很好的印證，說明用纖維素降解透明水解圈方法大量篩選纖維素降解菌快速、簡便可行。通過對4株纖維素降解菌形態(tài)觀察、鏡檢和26S rDNA基因序列分析同源性比對，由系統發(fā)育樹進行分析初步確定SN-1屬于黑曲霉(Aspergillusniger)，SN-2屬于赤霉(Gibberellamoniliformis)，SN-3屬于鏈格孢霉(Alternarianees)，SN-4屬于青霉菌(Penicilliumitalicum)。

研究采用透明圈篩選法識別產纖維素酶的菌株，其產酶能力和透明圈大小成正比。以此判斷出4種真菌分解纖維素的能力按大小排序為黑曲霉、青霉菌優(yōu)于交鏈孢霉和串珠狀赤霉。通過對CMC糖化酶活力、濾紙酶活性的分析也得到相同的結果。向殿軍等[11]從玉米秸稈中也分離出青霉菌，并且其纖維素酶活性最高。張恒芳等[22]從玉米秸稈中分離出2株纖維素分解菌，并且證實這兩株菌在溫度較低時也具有很強的纖維分解能力，但未鑒定出這2株菌的屬種。郭艷等[23]從玉米秸稈還田的土壤中分離了一株纖維素分解菌為假單胞菌(Pseudomondaceae)，其具有極強的分解有機物的能力，這表明某些細菌也具有較強的分解纖維素的能力。

研究通過對堆放的棉花秸稈中降解纖維素的微生物進行分離鑒定，主要發(fā)現4種真菌，在今后研究中，可將研究分離的這4株菌進行耐受性研究，以期篩選出極端環(huán)境下任具有纖維分解能力的菌株，并進行一定的定向誘變。此外，由于菌種功能性研究，尤其是對于秸稈的降解效率研究工程量較大，許多問題有待進一步深入研究。諸如提高降解效率，更為有效的利用微生物處理手段，更方便、更快捷高效的使用菌劑，延長棉花秸稈降解菌劑的保質期，進行棉花秸稈降解菌劑的安全性評價，使用菌劑還田解決棉花生長常見的枯萎病和黃萎病的問題等等[7]。

4 結 論

4.1 棉花秸稈表面分離提取鑒定出4種真菌分別為，黑曲霉(Aspergillusniger)、串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis)、交鏈孢霉(Alternarianees)和青霉菌(Penicilliumitalicum)。

4.2 對于4種真菌降解棉花秸稈的理論效果，按抑菌圈大小排序為：黑曲霉>青霉菌>鏈格孢霉>赤霉。對于CMC-Na糖化酶活力、濾紙酶活性接種黑曲霉和青霉菌時活性在120 h之內均為最強。

4.3 實際降解棉稈25 d，降解效果表現最好的為黑曲霉和青霉菌。

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