穆敏婕，白 蘭，陳換飛，陳 婷，謝達春，張 梅

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611372；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

近年來，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究的快速發(fā)展，眾多癌癥治療靶標(biāo)以及與癌癥相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路組件被人類發(fā)現(xiàn)和確證。許多激酶的異常過表達直接導(dǎo)致了染色體的不穩(wěn)定以及多種抑癌因子和癌蛋白調(diào)節(jié)通路的混亂，而在眾多腫瘤治療性靶點中，Aurora-A激酶近年來備受關(guān)注。

Aurora激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括Aurora-A、Aurora-B、和Aurora-C，以調(diào)控中心體的功能、兩極紡錘體的形成以及染色體的分離而為人們所熟知[1]。其中，Aurora-A是Aurora激酶中研究最多也是最重要的一種亞型，位于中心體和紡錘體以及紡錘體微管，在有絲分裂初期開始上調(diào)，參與對細(xì)胞凋亡和有絲分裂的調(diào)節(jié)等。

本課題組在前期實驗中，以Aurora-A為抗癌治療靶點，利用計算機輔助設(shè)計技術(shù)設(shè)計并合成了吡啶類化合物XY-4，通過藥理實驗證明，XY-4對多種不同組織來源的腫瘤細(xì)胞具有抑制其增殖的作用，對人肺癌A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞、人胃癌HGC-27細(xì)胞以及小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的抑制作用。多種體外實驗均顯示，化合物XY-4是以Aurora-A作為抗癌治療靶點的極具潛力的活性化合物。因此建立一種快捷簡便、準(zhǔn)確實用的分析方法測定其純度，對于活性化合物的制備以及后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)研究十分必要。本文參考文獻[2～9]，使用高效液相色譜法，對XY-4的純度進行跟蹤測試，指導(dǎo)化學(xué)合成。其制備方法如圖1[10]：

圖1 XY-4制備方法

1 材料與方法

1.1儀器高效液相色譜儀e2695，美國waters；PDA檢測器2998，waters；電子天平JA1003，上海順宇恒平科學(xué)儀器；超聲清洗器KQ-2200，昆山超聲儀器；實驗室純水系統(tǒng)KM-UPT-8/15/20，Millipore。

1.2試劑色譜甲醇，阿拉丁試劑公司；超純水由純水系統(tǒng)制備。

1.3方法

1.3.1色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini 5 μm C18 110 A色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇/水(V∶V=75∶25)；流速1 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm；進樣量為20 μl。

1.3.2樣品準(zhǔn)備

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液 取XY-4標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解使成10 ml，精密量取1 ml該標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至0.1 mg/ml，過0.45 μl微孔濾膜后HPLC進樣分析。

1.3.2.2供試品溶液 取XY-4供試品10 mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解使成10 ml，精密量取1 ml該標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至0.1 mg/ml，過0.45 μl微孔濾膜后HPLC進樣分析。

1.3.2.3陰性對照品溶液 取XY-4的合成原料2-氯-3-氰基吡啶、鄰甲氧基苯甲酸等，按照投料比分別稱取，不加入催化劑也不加熱啟動反應(yīng)，原料混合后直接進行產(chǎn)物的后處理步驟，所得物質(zhì)按3.2方法制備陰性對照品溶液。

1.3.3方法學(xué)考察

1.3.3.1陰性干擾試驗 取1.3.2項下的三種溶液，按擬定的色譜方法進行測定。

1.3.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取XY-4對照品液稀釋成濃度分別為100、90、80、60、40、20 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述色譜條件分別進樣分析，記錄峰面積，以XY-4的檢測濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y進行線性回歸分析。

1.3.3.3精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液20 μl，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。

1.3.3.4穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后0、4、8、12、16、20、24 h時依照上述方法進樣測定。

1.3.3.5重復(fù)性試驗 取同一批樣品，分別依法制備6份供試品溶液并測定含量。

1.3.3.6加樣回收試驗 稱取已知含量的同一批，含量為950.4 mg/g樣品1.052 mg共6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入1 mg/ml XY-4對照品溶液 0.8、1.0、1.2 ml，依法制備供試溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。

2 結(jié)果

2.1方法學(xué)考察結(jié)果陰性干擾試驗結(jié)果如圖2所示，陰性對照品溶液的色譜圖中，在XY-4相應(yīng)位置無干擾峰出現(xiàn)，表明陰性對照組的其他成分對XY-4的含量測定無干擾；線性回歸考察結(jié)果如圖3所示，回歸方程為Y=7093.9X-4606.5，r=0.9999(n=7)，結(jié)果表明，XY-4在20～100 μg/ml的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好；精密度試驗，峰面積的平均值為706019，RSD為1.06%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗結(jié)果，峰面積的平均值為705839，RSD為1.23%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合測量要求；重復(fù)性試驗結(jié)果如表1所示，XY-4平均含量為 950 mg/g，RSD為0.03%(n=6)，方法重復(fù)性良好；加樣回收試驗結(jié)果如表2所示，XY-4平均回收率為97.6%，RSD為1.45%(n=6)。

圖2 陰性干擾試驗高效液相色譜圖 A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照品溶液

圖3 XY-4標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品序號XY?4含量(mg/g)平均值(mg/ml)RSD(%)1234569506951095059502950195029504003

表2 XY-4加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.2樣品測定結(jié)果取三批合成所得產(chǎn)品，依法測定，測得XY-4別為920.6、945.3及900.5 mg/g，經(jīng)計算表明，產(chǎn)品XY-4純度達98%以上，純度較高。

3 討論

Aurora激酶作為一個重要的抗癌藥物靶點，吸引了大量制藥公司及科研機構(gòu)對其抑制劑進行研究，開發(fā)和改造，例如選擇性Aurora-A激酶抑制劑MLN-8054、MLN8237、ENMD-2076，多重激酶抑制劑MK0457(VX-680)、ZM447493等[11]。所以，Aurora抑制劑的開發(fā)與改造對于癌癥的治療意義重大。

根據(jù)不同的適應(yīng)條件以及要求，純度的測定方法包括高效液相色譜法(HPLC)法，半定量的薄層色譜法(TLC)法，差示掃描量熱(DSC)法，軟電離質(zhì)譜法和核磁共振(NMR)法等，而目前使用最多的就是高效液相色譜法。本課題從化合物XY-4的物理性質(zhì)以儀器設(shè)備條件和可操作性等方面考慮，最終選擇了操作簡便，檢測精確的高效液相色譜法來對XY-4化合物的純度進行測定，并對測定方法進行了考察。

將XY-4標(biāo)準(zhǔn)品進行光譜掃描，在230 nm處有最大吸收，靈敏度最高且其余物質(zhì)對XY-4的吸收影響最小，故選擇230 nm為測定波長。試驗中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水等不同流動相體系，結(jié)果采用甲醇-水(75∶25)為流動相時，分離較好且柱效較高，故選擇甲醇-水(75∶25)為流動相。試驗對方法的專屬性進行了考察，輔料對XY-4的測定無干擾且繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達到0.9999?；厥章史从沉朔治龇椒ǖ臏?zhǔn)確度，反映了在確定分析條件下樣本濃度測定的準(zhǔn)確性，一般樣品的回收率應(yīng)該在85%～115%，試驗結(jié)果中平均回收率達到97.6%，RSD為1.45%，說明該方法測定較為準(zhǔn)確。同時，精密度試驗中的RSD值為1.06%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

綜上，本高效液相色譜法測定XY-4化合物純度，簡便易行，準(zhǔn)確可靠，出峰速度快，峰形和分離度等均符合測定要求，適合跟蹤合成反應(yīng)進程和檢測產(chǎn)品純度。

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