宋紅霞， 付 超， 侯雷平， 李梅蘭

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801)

普通白菜(Brassicarapasubsp.chinensis)是典型的低溫長日照二年生蔬菜，需要經(jīng)過一段時(shí)間低溫處理，通過春化，才可以在高溫長日照條件下現(xiàn)蕾開花，而花芽分化是現(xiàn)蕾開花的前提，也是普通白菜從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的形態(tài)標(biāo)志[1]。詳細(xì)的分化過程是開花調(diào)控機(jī)制研究的理論基礎(chǔ)，同時(shí)對制定合理的栽培措施進(jìn)行花期調(diào)控及實(shí)現(xiàn)分子遺傳調(diào)控也有重要意義[2]。

石蠟切片技術(shù)是組織學(xué)和生物學(xué)研究的主要方法，傳統(tǒng)石蠟切片的制作一般須經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、染色及封固等步驟[3]。在植物組織石蠟切片采用的染色方法中，染料的選擇、操作方法和染色時(shí)間等都是影響染色成敗的重要因素[4]。不少植物學(xué)研究者針對不同染色材料采用不同的染色方案和染色時(shí)間，探索了不同材料的最佳染色方法，如在粳稻穎果石蠟切片中對染色時(shí)間的摸索[5]，以及對韭菜、樺樹松蘿、水稻等染色方法的研究[6-8]。

關(guān)于普通白菜花芽分化的發(fā)生，李曙軒等已經(jīng)進(jìn)行過相關(guān)研究[9-10]，但對于石蠟制片方法沒有進(jìn)行報(bào)道而且分化過程不夠詳盡。因此，本試驗(yàn)以75#普通白菜為試驗(yàn)材料，對石蠟切片制作過程中不同染色方法、染色時(shí)間進(jìn)行比較，并對花芽分化過程進(jìn)行詳細(xì)研究，以期為普通白菜的生殖發(fā)育研究提供理論支撐，也為白菜類蔬菜石蠟切片的染色方法提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

供試普通白菜75#為弱冬性自交系，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所惠贈。

選取飽滿且較為整齊一致的種子，用清水漂洗后于55 ℃水浸泡10 min，室溫浸種2 h，然后置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃恒溫光照人工氣候室內(nèi)催芽，光照時(shí)間 16 h/d。待胚根突破種皮后，將培養(yǎng)皿移至4 ℃冰箱，黑暗、低溫處理20 d，其間保證種子萌發(fā)需要的水分[11]，處理結(jié)束后將幼苗種植于50孔穴盤中，內(nèi)含泥炭-蛭石基質(zhì)混合物(3 ∶1)，在溫室進(jìn)行常規(guī)栽培管理(白天最高溫度30 ℃，夜間最低溫度10 ℃，光照時(shí)間約11 h/d)。

1.2 方法

1.2.1 取樣 待7張真葉展開后，每隔2 d剝?nèi)∏o尖，在體視顯微鏡(Olympus SZX16)下觀察發(fā)育時(shí)期，參照李曙軒等方法對不同花芽分化等級進(jìn)行取樣[9，12]。

1.2.2 固定包埋 參照Garcês等的方法[13-14]將樣品進(jìn)行包埋，之后放于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 切片 參照高行英的方法[15]，切片厚度為8 μm。

1.2.4 展片與粘片 以多聚賴氨酸(Sigma)為粘片劑，展片鍋的溫度為37 ℃恒溫，將切下的蠟片放在液面上，光面朝下，蠟片展平后，將處理好的載玻片伸入水中，撈起蠟片，放在干凈的工作臺上，晾干。

1.2.5 脫蠟 為了將組織中的蠟去除，按照以下步驟進(jìn)行操作：二甲苯10 min→1/2二甲苯+1/2純乙醇10 min→純乙醇5 min→95%乙醇10 min→85%乙醇10 min→70%乙醇5 min，逐級脫蠟。

1.2.6 染色方法及時(shí)間篩選 番紅(AMRESCO)配方：1 g番紅，100 mL 50%乙醇，過濾。固綠(AMRESCO)配方：0.5 g固綠，100 mL 95%乙醇。

番紅染色步驟：番紅液xh→70%乙醇1 min→85%乙醇1 min→純乙醇2 min→二甲苯3 min→二甲苯3 min。先設(shè)置3個(gè)較大的時(shí)間梯度：2、12、24 h，再在合適的時(shí)間內(nèi)設(shè)置相對較小的時(shí)間梯度：0.5、1、2、4、6、8 h，以確定番紅染色的最佳時(shí)間。

固綠染色步驟：固綠ys→純乙醇30 s→純乙醇2 min→二甲苯3 min→二甲苯3 min，染色時(shí)間：10、20、30 s。

番紅-固綠對染：番紅液xh→70%乙醇1 min→85%乙醇1 min→固綠ys→純乙醇30 s→純乙醇1 min→二甲苯 3 min→二甲苯3 min，番紅-固綠對染時(shí)間根據(jù)最佳時(shí)間進(jìn)行搭配組合。

1.3 普通白菜花芽分化過程的觀察

應(yīng)用“1.2”節(jié)中得到的最佳染色方法將普通白菜的頂端部位進(jìn)行組織切片，以觀察主枝、側(cè)枝花芽分化，分析其形態(tài)發(fā)生過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 番紅單獨(dú)染色切片效果

根據(jù)圖1的對比效果可以看出，染色12、24 h的組織較暗淡，而且染色24 h的組織清晰度不及染色2、12 h，染色2 h的組織清晰度最高，切片最為鮮亮，所以進(jìn)一步設(shè)置小梯度時(shí)染色時(shí)間小于12 h。為了避免錯(cuò)過最好的染色時(shí)間，小于2 h也設(shè)置2個(gè)梯度，以考察小于2 h是否會有更佳的效果，因此小梯度染色時(shí)間設(shè)為0.5、1、2、4、6、8 h。

從圖2可以看出，染色8 h時(shí)色彩暗淡，清晰度低；染色 6 h 組織的清晰度較好且均勻，但對比大量同時(shí)間段的切片染色效果可知，其染色穩(wěn)定性差；染色4 h組織的清晰度較好但不均勻，其染色穩(wěn)定性也差；染色2 h組織的清晰度高，均勻性好，其染色穩(wěn)定性均比其他時(shí)間段要好；染色0.5、1 h時(shí)組織色彩較淺，清晰度不高，均勻性較差。本研究結(jié)果說明，番紅最佳的染色時(shí)間為2 h。

2.2 固綠單獨(dú)染色切片效果

觀察不同固綠染色時(shí)間的染色效果(圖3)得出，單獨(dú)采用固綠對組織進(jìn)行染色其清晰度均不高，不便于對花芽分化進(jìn)程的觀察。

2.3 番紅-固綠對染切片染色效果分析

番紅-固綠對染時(shí)番紅采用的最佳染色時(shí)間為2 h，固綠設(shè)置10、20、30 s 3個(gè)染色時(shí)間梯度。比較幾種方法可知，固綠染色10、20 s效果均不清晰；固綠染色30 s效果清晰，但2個(gè)固綠染色30 s的處理中30 s-1的顏色明顯深于30 s-2(圖4)。對比大量同時(shí)間段的切片染色效果，發(fā)現(xiàn)番紅-固綠對染穩(wěn)定性不高，說明番紅-固綠對染不適合對普通白菜花芽分化進(jìn)程的觀察。

2.4 普通白菜花芽分化形態(tài)學(xué)鑒定

采用番紅單染2 h制作石蠟切片，進(jìn)行顯微鏡觀察，將普通白菜花芽分化(葉原基經(jīng)花原基到單花器官分化)分為圖5中的8個(gè)階段：0級(營養(yǎng)生長期)，生長點(diǎn)比較平坦，周緣有許多尖錐形的葉原基(圖5-A)；1級(營養(yǎng)生長向生殖生長過渡期)，莖端生長點(diǎn)開始膨大，寬度、高度同時(shí)增加，其頂端逐漸變圓，隆起呈半圓狀突起，生長點(diǎn)周緣仍不斷分化葉原基，根據(jù)發(fā)育時(shí)間的長短，生長點(diǎn)隆起的高低稍有差異(圖 5-B、C)；2級(花原基分化初期)，莖端生長點(diǎn)繼續(xù)膨大伸長，具有1個(gè)中心圓突起，四周有2～3個(gè)小圓突起，即為花原基，這個(gè)階段葉原基分化停止(圖5-D)；3級(花原基分化盛期)，周圍圓突起陸續(xù)增加，并不斷發(fā)育增大伸長，可明顯看到形成圓突群，花原基伸長長短依分化時(shí)間長短而異(圖5-E、F)；4級(花柄伸長期)，花柄開始伸長，但不太長，萼片沒有分化，圓突群分化為花蕾雛形(圖5-G)；5級(花萼原基分化期)，花柄繼續(xù)伸長，主莖第1花原基頂端周緣對稱分化出新月形突起，即為花萼原基(圖5-H)；6級(雌雄蕊原基分化期)，當(dāng)花萼伸長將包圍整個(gè)花原基時(shí)，在花芽中心生長錐基部，萼片腋間出現(xiàn)的對稱突起為雄蕊原基，隨著雄蕊原基的發(fā)育，花芽中心生長錐頂部凹陷，四周呈現(xiàn)環(huán)狀突起，即雌蕊原基開始分化(圖5-I、J)；7級(花瓣原基分化期)，在雌蕊原基分化的同時(shí)，萼片原基的內(nèi)側(cè)對稱分化出箭頭狀突起，即為花瓣原基(圖5-K)。至此，普通白菜已完成其主枝從葉原基經(jīng)花原基到單花器官的分化，再經(jīng)過大約2～3 d的時(shí)間，花蕾便肉眼可見。

普通白菜花芽分化從主枝生長點(diǎn)開始，生長點(diǎn)原基按照由外向內(nèi)的次序依次進(jìn)行，主枝先進(jìn)行，一級側(cè)枝次之。當(dāng)主枝花柄伸長時(shí)，一級側(cè)枝已經(jīng)形成，但生長點(diǎn)較為平坦，還未開始花芽分化(圖6-A)；當(dāng)主枝萼片原基形成時(shí)，生長點(diǎn)隆起呈半球狀，一級側(cè)枝花芽進(jìn)入分化期(圖6-B)；當(dāng)主枝達(dá)到雄、雌蕊原基分化期，最早長出的一級側(cè)枝花芽進(jìn)入萼片分化期(圖6-C)，隨后的分化過程同主花序；一級側(cè)枝花芽分化的次序由頂部向基部依次進(jìn)行(圖6-D)。按照這樣的規(guī)律，普通白菜完成單株花芽分化。

3 討論

3.1 不同染色方法和時(shí)間的篩選

番紅、固綠為植物組織學(xué)最常用的2種染料，番紅的染色時(shí)間一般為2～24 h，固綠一般為10～60 s[16]。對于不同材料和染色試劑，染色時(shí)間應(yīng)該根據(jù)試驗(yàn)材料、取樣的時(shí)期和部位，在借鑒他人成熟方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行探索。于曉剛等研究指出，粳稻花后不同時(shí)間的穎果最佳染色時(shí)間差異很大，發(fā)育前期的穎果幼嫩，固綠染色時(shí)間需要20～25 s，而后期的穎果染色時(shí)間只需要10～20 s[5]。王寧等指出，草莓采用番紅-固綠對染的效果優(yōu)于單獨(dú)采用番紅或固綠[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)采用番紅染色時(shí)，設(shè)置0.5～24 h染色，觀察同時(shí)間段的切片染色效果，結(jié)果表明，2 h染色效果最均勻、穩(wěn)定，且色彩鮮亮，便于觀察；單獨(dú)采用固綠染色時(shí)，普通白菜組織結(jié)構(gòu)不夠清晰，不便于觀察；采用番紅-固綠對染的穩(wěn)定性均相對較差。因此，對75#普通白菜花芽的分化過程進(jìn)行觀察中采用番紅單獨(dú)染色2 h。

3.2 普通白菜花芽分化的形態(tài)學(xué)研究

在白菜的花芽分化研究中，李曙軒等對于白菜的分化過程僅觀察到花原基分化結(jié)束，并將該過程分為6級，對于單花器官的發(fā)生沒有進(jìn)行報(bào)道[9]；王真真等未涉及不結(jié)球白菜花原基的發(fā)生盛期、側(cè)枝花芽的發(fā)生過程，將花芽分化進(jìn)程分為7級[10]。本試驗(yàn)對上述研究進(jìn)行了詳細(xì)補(bǔ)充，將普通白菜花芽分化過程分為8級，并完善了側(cè)枝花芽的分化過程。本試驗(yàn)中花柄伸長時(shí)期就已經(jīng)觀察到側(cè)枝花芽的發(fā)生，與李曙軒等的研究結(jié)果[9]一致，但早于王真真等的研究結(jié)果[10]，因此關(guān)于普通白菜側(cè)枝花芽的發(fā)生時(shí)期還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)觀察到側(cè)枝花芽的發(fā)生順序?yàn)橛身敳肯蚧恳来畏只c惠麥俠等對于大白菜的研究結(jié)果[18]一致，但與陳機(jī)的研究結(jié)果[19]不一致，可見對于白菜類蔬菜側(cè)枝花芽分化的順序還有待進(jìn)一步研究。

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