程杰杰， 殷超凡， 薩爾山別克·熱阿合曼， 孫帥欣， 陳云鵬

[上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240]

氮元素作為構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的重要元素，對(duì)動(dòng)植物及微生物都有非常重要的意義。土壤氮素在作物氮素供應(yīng)上占有重要地位，通過向耕地中增施氮肥來提高作物產(chǎn)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要措施[1]?？諝庵须m然存在大量的氮?dú)猓荒苤苯颖恢参镂绽?，只有轉(zhuǎn)化為硝酸鹽、亞硝酸鹽等化合物后才能被植物吸收。生物固氮即固氮微生物將大氣中的氮?dú)膺€原成氨的過程，是自然界氮循環(huán)的主要環(huán)節(jié)[2]。當(dāng)前氮肥的主要來源是化工生產(chǎn)，化學(xué)氮肥的使用曾為我國(guó)農(nóng)作物的增產(chǎn)作出了突出貢獻(xiàn)[3-4]，但同時(shí)產(chǎn)生很多環(huán)境問題，造成農(nóng)業(yè)點(diǎn)源污染和面源污染[5-7]。

由于氮素化肥的生產(chǎn)伴隨著能源的消耗和日趨嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題，因此生物固氮研究日益受到各國(guó)政府的重視。目前發(fā)現(xiàn)的具有生物固氮能力的微生物多為細(xì)菌，有100多個(gè)屬，占細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)育分支的1/2以上[8]。不同固氮菌的固氮能力差異比較明顯，即使是同種固氮菌在不同的環(huán)境條件下或在不同的宿主內(nèi)也會(huì)表現(xiàn)出固氮能力的差異[9]。雖然固氮菌的固氮能力差異較大，但均能在一定程度上促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量[10]。

本研究測(cè)定固氮菌GXGL-4A在LB液體培養(yǎng)基(有氮)、A15液體培養(yǎng)基(無氮)中的生長(zhǎng)曲線；以玉米、水稻為試驗(yàn)對(duì)象，在其生長(zhǎng)過程中施用不同濃度的GXGL-4A，通過測(cè)定玉米、水稻的鮮質(zhì)量、株高、根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量等指標(biāo)，并進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，GXGL-4A對(duì)水稻和玉米的生長(zhǎng)具有促生作用，且該促生作用在一定范圍內(nèi)隨GXGL-4A濃度的增大而增強(qiáng)；對(duì)GXGL-4A在玉米根際土壤中的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，獲得其在玉米根際土壤中的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化情況，可為固氮菌固氮機(jī)制的進(jìn)一步研究及微生物菌肥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 固氮菌KosakoniaradicincitansGXGL-4A(簡(jiǎn)稱GXGL-4A)分離自廣西桂林的玉米根部，為革蘭氏陰性菌，有莢膜，能泌銨和胞外多糖類黏性物質(zhì)，菌體大小約為1.5 μm×0.5 μm。菌體呈桿狀，具端生鞭毛。

載體質(zhì)粒pET28a(+)攜帶有卡那霉素抗性基因(kanr)標(biāo)記，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室余傳金惠贈(zèng)。

1.1.2 種子 玉米種子先玉335(非抗旱品種)和寧玉721(抗旱品種)均購自青上農(nóng)業(yè)科技(吉林)有限公司，水稻種子CBB23由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院陳功友教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑及儀器 2×TaqPCR Master Mix、6×Loading buffer、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA marker，購自天根生化科技(北京)有限公司；Goldview核酸染料，購自上海少辛生物科技有限公司；卡那霉素(Kan)，購自美國(guó)Amresco公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Leica DM2500熒光顯微鏡(萊卡微系統(tǒng)公司)；BSW-200B 臺(tái)式恒溫?fù)u床(上海啟步生物科技有限公司)；ZDP-2120電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；Minispin?離心機(jī)、Eppendorf BioPhotometer生物分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf公司)；超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 固氮菌GXGL-4A生長(zhǎng)曲線測(cè)定 以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量將固氮菌GXGL-4A接入LB液體培養(yǎng)基(有氮)中，每隔1 h用分光光度計(jì)測(cè)量1次菌液在600 nm處的吸光度并進(jìn)行記錄。以相同接種量將固氮菌GXGL-4A接入A15液體培養(yǎng)基(無氮)中，8 h后以相同方法測(cè)量菌液在600 nm處的吸光度并進(jìn)行記錄，以后每隔3 h進(jìn)行1次測(cè)量。

1.2.2 固氮菌GXGL-4A促生作用研究

1.2.2.1 種子消毒與催芽 將種子在水中浸泡4 h后，用蒸餾水徹底沖洗干凈，然后移至75%乙醇中處理2 min，用無菌水清洗2次后，用5% NaClO溶液浸泡5 min，再用無菌水清洗2次。將消毒的玉米和水稻種子用紗布包起來后置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出芽，出芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根與種子等長(zhǎng)。

1.2.2.2 固氮菌GXGL-4A的培養(yǎng) 將固氮菌GXGL-4A以1%接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)約4 h(D600 nm約為1.0)，然后在離心機(jī)中以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，用無菌水洗滌菌體沉淀2次后，再用無菌水將其依次稀釋為104、106、108CFU/mL等3個(gè)濃度梯度，備用。

1.2.2.3 玉米、水稻種植與接種處理 將發(fā)芽的玉米種子植入塑料花盆(內(nèi)徑20 cm、高20 cm)，出苗期每隔24 h于同一時(shí)間(12：00)澆水1次，觀察記錄出苗情況。將大小長(zhǎng)勢(shì)基本一致的玉米、水稻幼苗分別移栽到相同規(guī)格的塑料花盆內(nèi)，設(shè)置對(duì)照組(CK)和3個(gè)濃度梯度(104、106、108CFU/mL)試驗(yàn)組，3次重復(fù)。移栽2 d(展出1或2張真葉)后，試驗(yàn)組每隔3 d對(duì)幼苗莖基部施加1次固氮菌GXGL-4A(1 mL/株)，對(duì)照組加等量無菌水，共計(jì)接種7次，培養(yǎng)期間每天12：00澆1次水，以保持土壤濕潤(rùn)。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)采集與分析 接種后30 d，測(cè)量每株玉米、水稻的鮮質(zhì)量、株高、根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel和SPSS進(jìn)行分析處理。

1.2.3 根際定殖動(dòng)態(tài)研究

1.2.3.1 固氮菌GXGL-4A卡那霉素抗性標(biāo)記 將帶有pET28a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)約 12 h，然后用試劑盒提取質(zhì)粒。將提取好的質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入固氮菌GXGL-4A中，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，然后挑取陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3.2 土壤處理 采集大田熟土600 g，稱取其中的300 g平鋪于托盤內(nèi)，置于120 ℃恒溫箱內(nèi)干熱滅菌5 h，待土壤自然冷卻后裝入無菌袋內(nèi)備用；剩余土壤不進(jìn)行滅菌處理，而是直接裝入無菌袋內(nèi)備用。

1.2.3.3 種子消毒與催芽 種子消毒與催芽方法同 “1.2.2.1” 節(jié)。種子出芽后，播種于含50 g滅菌土的塑料采樣罐(高10 cm，內(nèi)徑6 cm)內(nèi)，即為封閉系統(tǒng)處理；播種于含50 g非滅菌土的塑料采樣罐內(nèi)，即為開放系統(tǒng)處理。每罐播3粒種子，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3.4 標(biāo)記菌GXGL-4A的培養(yǎng)及在玉米根際土壤的釋放 待種子破土后，采用灌根法接種固氮菌GXGL-4A。標(biāo)記菌于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，取5 mL用無菌水稀釋至 50 mL(接種濃度1×107CFU/mL)，用移液器緩慢地釋放至玉米幼苗的根際土壤中。

1.2.3.5 消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 分別于釋放后1、3、6、9、12、15 d取3罐幼苗根際土壤各1 g，加入到9 mL無菌水中渦旋振蕩 15 min，即為10-1稀釋度，根據(jù)含菌量用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋后菌液200 μL涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行過夜培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿的菌落數(shù)，計(jì)算平均1 g根際土壤的含菌量。試驗(yàn)時(shí)以釋放后1 h回收的細(xì)菌數(shù)量為初始接種量。

1.2.3.6 數(shù)據(jù)采集與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel和SPSS進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌GXGL-4A生長(zhǎng)曲線分析

由圖1、圖2可知，固氮菌GXGL-4A在LB液體培養(yǎng)基(富氮)、A15液體培養(yǎng)基(無氮)中均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度不同。在LB液體培養(yǎng)基(富氮)中生長(zhǎng)迅速，接種后約1 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在測(cè)定時(shí)間內(nèi)其D600 nm一直增大；而在A15液體培養(yǎng)基(無氮)中細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，接種后約10 h才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約20 h達(dá)到生長(zhǎng)最大值，之后其D600 nm逐漸減小。據(jù)此可知，在營(yíng)養(yǎng)較豐富的條件下，固氮菌GXGL-4A生長(zhǎng)迅猛，而在無氮條件下，固氮菌GXGL-4A雖也能生長(zhǎng)，但增殖緩慢，這一結(jié)果表明，氮營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)固氮菌的生長(zhǎng)至關(guān)重要。

2.2 固氮菌GXGL-4A促生作用分析

由表1至表3、圖3至圖9可知，試驗(yàn)組玉米先玉335、寧玉721及水稻CBB23植株的株高、根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量、植株鮮質(zhì)量等指標(biāo)與對(duì)照組植株整體上差異明顯，固氮菌GXGL-4A對(duì)水稻CBB23的促生效果較2個(gè)供試玉米品種更好。

2.3 固氮菌GXGL-4A根際消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析

從圖10可以看出，接種后1～15 d均可以從玉米植株根際土壤中檢測(cè)到標(biāo)記菌，在封閉系統(tǒng)與開放系統(tǒng)內(nèi)，玉米根際土壤的標(biāo)記菌數(shù)量變化趨勢(shì)基本一致，均先增加后減少，并且均在釋放1 d后達(dá)到最大值；在相同的接種濃度(1×107CFU/mL)下，封閉系統(tǒng)內(nèi)標(biāo)記菌GXGL-4A的數(shù)量明顯高于開放系統(tǒng)，其原因可能是滅菌土內(nèi)的微生物數(shù)量較少，接種后，固氮菌GXGL-4A迅速占據(jù)玉米根際土壤生態(tài)位而成為優(yōu)勢(shì)種群，而在自然土內(nèi)微生物群落非常復(fù)雜，接種后，固氮菌GXGL-4A與土壤中的原始微生物進(jìn)行生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致接種后標(biāo)記菌數(shù)量低于滅菌土。

表1 不同處理下玉米品種先玉335的生物量

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。下表同。

表2 不同處理下玉米品種寧玉721的生物量

表3 不同處理下水稻品種CBB23的生物量

3 討論與結(jié)論

微生物的固氮作用在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)中具有十分重要的意義。本研究表明，固氮菌GXGL-4A在營(yíng)養(yǎng)較豐富的條件下生長(zhǎng)迅速，在無氮條件下也可通過自身固氮作用利用空氣中的氮?dú)饩S持自身生長(zhǎng)，它對(duì)玉米和水稻生長(zhǎng)具有顯著促生作用，整體上來看，施加固氮菌后的供試植株在株高、根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量及植株鮮質(zhì)量等方面較對(duì)照植株生物量明顯提高。在一定濃度范圍內(nèi)，其促生作用隨菌液濃度的增加而增強(qiáng)，尤其是根系表現(xiàn)最為明顯，固氮菌GXGL-4A能在根際土壤中迅速定殖并成為優(yōu)勢(shì)種群，推斷其促生作用主要是通過根部定殖來實(shí)現(xiàn)的。

先前已有一些關(guān)于植物根際促生菌(plantgrowth promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR)的研究，主要集中在PGPR菌株的篩選、入侵機(jī)制以及促生機(jī)制等方面[11-13]，研究結(jié)果表明，PGPR可通過固氮、解磷及產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等方式來促進(jìn)植物生長(zhǎng)[14-17]。對(duì)固氮菌的定殖觀測(cè)表明，固氮醋酸桿菌能從根尖和側(cè)根發(fā)生的周圍侵染植物[18]，而固氮螺菌能在根表與皮層之間的周質(zhì)空間內(nèi)定殖[19]。雖然固氮菌所固定的氮素供給植物的很少，但細(xì)菌死亡后釋放的有機(jī)氮能逐步被植物吸收利用，此外，固氮菌可以分泌許多有機(jī)酸使植物根際pH值下降，使難溶性礦物質(zhì)變得易溶，從而促進(jìn)植物根系對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[20-21]。

本研究聚焦于固氮菌GXGL-4A的固氮促生作用，在后續(xù)研究中，將借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探究其固氮促生機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行遺傳改造，使其具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力和固氮能力，甚至開發(fā)成可施性生物肥料，應(yīng)用前景廣闊。

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