馮 穎， 張金秋， 顧地周， 孫忠林， 苗婷婷

(通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/吉林省長白山植物種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點實驗室，吉林通化 134002)

牛尾菜(SmilaxripariaDC)別稱鞭鞘子菜、鞭桿菜、千層塔，屬于百合科菝葜屬草質(zhì)藤木多年生宿根植物，雌雄異株，具短根狀莖[1]。其根狀莖可供藥用，具有活血化瘀[2]、祛風(fēng)活絡(luò)、祛痰止咳以及一定的抗癌功效[3]。牛尾菜分布較廣，國內(nèi)主要分布在北京、山東、河南、河北、吉林和黑龍江等地，主要生長于林下、平原、陰濕谷底。

牛尾菜種子屬于典型的后熟類種子，果實成熟后，種胚處于球形胚階段，這樣的種子播種后當(dāng)年不能萌發(fā)，需要2～3年才能少量發(fā)芽，生產(chǎn)和開發(fā)利用受到極大的限制[1]。本研究利用2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)聯(lián)合變溫結(jié)合赤霉素(GA3)和雪藏2種處理方法打破種子休眠，加快種子的萌發(fā)，探討種胚發(fā)育過程中淀粉酶活性的變化規(guī)律，為牛尾菜種苗繁育和人工栽培奠定理論實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牛尾菜種子采自吉林省集安市臺上村。

β-極限糊精；10 mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩沖液(pH值5.0)；0.1 mol/L NaAc緩沖液(含6 mol/L CaCl2、pH值 5.0)；DNS試劑；0.01% I2-KI溶液；2%可溶性淀粉；0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L不同濃度GA3。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)后熟處理 取種子用清水浸泡3～5 d后去除果皮、果肉、果穗以及漂浮在水面的種子，取水底的種子倒入4.50 mg/L 2，4-D、5.75 mg/L 6-BA混合溶液中，72 h后將種子撈出與濕沙以體積比 1 ∶3 攪拌均勻后裝入透氣性好的木槽中，覆蓋塑料薄膜置于處理室中進(jìn)行變溫處理。變溫幅度和時間分別為白天(23±2)℃，處理11 h，夜間溫度為 (11±2)℃，處理時間為13 h。處理期限定為30～80 d，控制木槽內(nèi)水分的相對濕度為70%，每隔5 d觀察種胚形態(tài)。隨機(jī)取100粒種子觀察種子發(fā)芽數(shù)，重復(fù)3次取平均值。盾形胚發(fā)生率=盾形胚種子數(shù)量/供試種子總數(shù)×100%，子葉胚發(fā)生率=子葉胚的種子數(shù)量/供試種子總數(shù)×100%[4]。

1.2.2 淀粉酶活性測定

1.2.2.1 粗酶液制備 取不同發(fā)育階段的牛尾菜種子各 2 g，按質(zhì)量體積比1 ∶2加入0.1 mol/L NaAc緩沖液(含 6 mol/L CaCl2，pH值5.0)4 mL及少量石英砂研磨后過濾，濾液以20 000 r/min離心20 min，上清液以10 mmol/L NaAc緩沖液透析過夜，20 000 r/min離心10 min，上清液定容備用。

1.2.2.2α-淀粉酶活性測定 取0.1～0.5 mL粗酶液，加0.5 mLβ-極限糊精和10 mmol/L NaAc緩沖液定容至 1.0 mL，搖勻，30 ℃保溫，隔5 min取0.1 mL反應(yīng)液加0.01% I2-KI溶液5.0 mL和蒸餾水0.4 mL，搖勻后在 560 nm 處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算β-極限糊精含量。

1.2.2.3β-淀粉酶活性測定 在具塞試管中加入2%淀粉5.0 mL，0.1 mol/L NaAc緩沖液(pH值5.0)1.0 mL和蒸餾水 3.9 mL，37 ℃預(yù)熱5 min，加酶液0.1 mL，保溫30 min后煮沸10 min，冷卻后取0.5 mL樣品、1.5 mL DNS試劑加入試管中，沸水浴中加熱15 min，冷卻后加10.0 mL蒸餾水，搖勻后在 540 nm 處測定吸光度。

1.2.3 生理后熟處理

1.2.3.1 GA3處理 變溫處理后洗凈種子，以0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L不同濃度梯度的GA3浸泡24 h。浸泡后的種子反復(fù)沖洗置于玻璃平皿中進(jìn)行發(fā)芽處理。

1.2.3.2 雪藏處理 變溫處理的方法同“1.2.3.1”節(jié)，到第2年1月末時挖1個土坑，將變溫后的種子與濕沙按照體積比1 ∶3拌均勻之后裝進(jìn)袋子里放入坑中，用土蓋好，到春天時將種子取出。

1.2.4 種子萌發(fā) 選擇形狀飽滿優(yōu)良的種子均勻地撒在鋪有2層潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中放入等量種子，重復(fù)3組，將裝有種子的培養(yǎng)皿放在恒溫25 ℃避光條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中給予適量的水分，保證種子能充分潤濕在濾紙上，每天換水保持種子濕潤，并每天11：00記錄發(fā)芽率。發(fā)芽率=種子發(fā)芽總數(shù)/供試的種子總數(shù)(100粒)×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用多項式回歸方程建立種胚不同發(fā)育階段淀粉酶活性變化趨勢線；利用多項式回歸方程建立GA3濃度與牛尾菜種子發(fā)芽率之間的關(guān)系，通過相關(guān)指數(shù)檢驗回歸顯著程度；通過F檢驗檢驗數(shù)據(jù)的方差齊性；非參數(shù)檢驗(K-S)檢測數(shù)據(jù)的正態(tài)性；利用雙樣本t檢驗雪藏處理與GA3處理之間發(fā)芽率的差異顯著性；數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛尾菜種胚的發(fā)育

10月下旬采集的牛尾菜種子，屬于典型的后熟品種，種子通常呈暗紅褐色，直徑4～5 mm，種子近球形，種胚為典型的球形胚(圖1-A)，發(fā)生率98%。后熟處理30 d，胚內(nèi)的生命活動活躍起來，在得到營養(yǎng)物質(zhì)和能量后開始分裂和生長，種胚發(fā)育成盾形胚(圖1-B)，發(fā)生率85%。后熟處理75 d，種胚發(fā)育成可萌發(fā)的子葉胚(圖1-C)，發(fā)生率達(dá)79%，此時完成形態(tài)后熟。一定濃度GA3處理25 d或者雪藏處理至第2年開春均可打破生理后熟，子葉突破種皮，種子發(fā)芽(圖1-D)。

2.2 牛尾菜種胚發(fā)育過程中α-淀粉酶、β-淀粉酶活性變化規(guī)律

未處理時，測得α-淀粉酶活性為(29.00±0.12)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性為 (7.24±0.32)U/mL；后熟處理30 d，α-淀粉酶活性為(31.98±0.56)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性為(9.28±0.15)U/mL；后熟處理75 d，α-淀粉酶活性為(33.96±0.69)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性為(10.02±0.58)U/mL。經(jīng)500 mg/L GA3處理24 h后常規(guī)發(fā)芽25 d，測得最高發(fā)芽率為72%，α-淀粉酶活性為(32.97±1.02)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性為(9.65±1.02)U/mL。由圖2趨勢線可知，在牛尾菜種胚發(fā)育過程中α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性逐漸升高，呈上升趨勢，根據(jù)方程推算，發(fā)育至75 d，α-淀粉酶活性為33.995 mg/(g·5 min)達(dá)到頂峰；發(fā)育至67.92 d，β-淀粉酶活性為10.04 U/mL，達(dá)到頂峰。種子萌發(fā)出芽至發(fā)芽最高峰所得數(shù)據(jù)顯示，之后α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性出現(xiàn)下降的趨勢。

推測可能是牛尾菜種胚發(fā)育期間細(xì)胞分裂以及細(xì)胞生長須要消耗大量能量，淀粉酶活性的不斷增加促進(jìn)胚乳中的淀粉水解為單糖等物質(zhì)，為細(xì)胞的生命活動提供可直接吸收的能量原料，當(dāng)發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚時，完成形態(tài)后熟，此時α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性達(dá)到最高。當(dāng)種胚突破種皮進(jìn)入發(fā)芽階段，α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性呈下降趨勢，可以認(rèn)為是胚乳中淀粉較多被利用而積累相對較少，且當(dāng)種胚突破種皮萌發(fā)出芽后，種子即進(jìn)入自養(yǎng)階段，可依靠光合作用合成自身所需能源物質(zhì)，故此時α-淀粉酶、β-淀粉酶活性呈下降趨勢。

2.3 不同濃度GA3對牛尾菜種子萌發(fā)的影響

變溫處理后未經(jīng)GA3處理的牛尾菜種子不發(fā)芽，經(jīng)0～800 mg/L不同濃度梯度GA3浸泡24 h處理后，在30 d達(dá)到萌發(fā)高峰，測得100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L濃度GA3浸泡的平均發(fā)芽率分別為15.30%、33.40%、45.57%、52.80%、71.87%、62.60%、58.23%、49.76%(圖3)。

試驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0分析處理得出回歸方程y=-0.000 2x2+0.234 3x-3.537 8，r2=0.965 2，回歸極顯著(P<0.01)，說明GA3對牛尾菜種子萌發(fā)具有極顯著影響。由趨勢線可知，GA3濃度在大于15.25 mg/L時，隨著濃度的升高，對牛尾菜種子發(fā)芽起促進(jìn)作用，發(fā)芽率呈上升趨勢。根據(jù)方程預(yù)測，GA3濃度為585.75 mg/L時，牛尾菜種子的發(fā)芽率最高，可達(dá)65.08%。GA3濃度高于最適濃度585.75 mg/L后，隨著濃度的升高，牛尾菜種子發(fā)芽受到抑制，發(fā)芽率呈下降趨勢(圖3)。

2.3 2種處理方法對牛尾菜種子萌發(fā)的影響

非參數(shù)檢驗(K-S)檢測結(jié)果表明，雪藏處理(P=0.98)與GA3處理(P=0.88)的發(fā)芽率數(shù)據(jù)可能來自正態(tài)總體；F檢驗結(jié)果顯示，二者處理的發(fā)芽率具有方差齊性(P>0.05)。雙樣本等方差t檢驗結(jié)果表明，雪藏處理組和GA3處理組均可顯著提高牛尾菜的萌發(fā)率，雪藏處理組較500 mg/L GA3處理組對種子的萌發(fā)效果更好(t=3.94，P=0.02)(表2)。經(jīng)比較雪藏在提高種子萌發(fā)率方面表現(xiàn)出相對優(yōu)勢，但處理時間較長，需要大約3個月的生理后熟時間，500 mg/L GA3處理組相對萌發(fā)率略低，但只需要20～30 d即可完成生理后熟，可根據(jù)具體生產(chǎn)實踐要求，選擇最適的處理方法。

表2 2種方法對牛尾菜種子萌發(fā)率的影響

注：t-檢驗：平均值的雙樣本分析，P<0.05與對照組比較差異顯著。

3 結(jié)論與討論

成熟后的牛尾菜種子在滿足萌發(fā)的自然條件下不能在短期內(nèi)迅速萌發(fā)出芽，這是因為牛尾菜種子需要一定的條件和時間來完成形態(tài)后熟和生理后熟，該狀況是由種子的種胚尚未發(fā)育完全或種子內(nèi)存在生長抑制因素等導(dǎo)致的。牛尾菜種胚為球形胚，屬于典型的后熟類種子，發(fā)育不完全，為單子葉植物，在促進(jìn)種子萌發(fā)的過程中需要經(jīng)過2個階段，第1個階段是形態(tài)后熟階段，即從球形胚、盾形胚發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚，此過程在4.50 mg/L 2，4-D和5.75 mg/L 6-BA浸泡 72 h 后變溫處理下完成[5]；第2個階段為生理后熟階段，即通過一定濃度的GA3或者雪藏處理打破生理休眠。本研究采用2，4-D、6-BA聯(lián)合變溫處理，通過激素調(diào)控結(jié)合溫度的變化，降低抑制種子萌發(fā)物質(zhì)的活性，使種內(nèi)促進(jìn)萌發(fā)的物質(zhì)得以激活，加快種胚的形態(tài)后熟，促進(jìn)種子的萌發(fā)[6]，溫度的變化幅度在2 ℃左右。

淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶等，它們廣泛存在于動物、植物和微生物界，α-淀粉酶和β-淀粉酶是植物中最重要的2種淀粉酶。本研究通過對經(jīng)后熟調(diào)控不同時期的牛尾菜種子α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的研究，探討種胚發(fā)育過程中淀粉酶活性的變化規(guī)律，可以反映某一時期內(nèi)牛尾菜體內(nèi)代謝的變化，分析其種胚發(fā)育機(jī)制，能為研究牛尾菜種胚發(fā)育調(diào)控和育苗技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

GA3是植物生長發(fā)育過程中的一類重要的調(diào)節(jié)激素，在植物生長發(fā)育過程中能夠解除種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，同時抑制脫落酸的作用，在試驗結(jié)果中可以確定GA3在牛尾菜種子打破休眠方面具有顯著作用，但過高的濃度會抑制種子的萌發(fā)，使發(fā)芽率逐漸下降。雪藏處理是一個操作比較簡單的處理方法，經(jīng)雪藏處理后種子的發(fā)芽率可達(dá)(76.53±1.47)%。有研究證明，雪藏處理經(jīng)歷春天天氣變暖，此時雪化為雪水，雪水對植物種子有一定的催芽作用，一方面雪水中含有的重水量少，比普通水少1/4，重水是一種放射性物質(zhì)，對植物的生命有強(qiáng)烈的破壞和抑制作用；另一方面雪水中含有的氮化物比普通水高很多，主要是雪花結(jié)構(gòu)較松散，具有較大的表面積，在雪花降落過程中能大量吸收空氣中的游離氮等物質(zhì)，這些氮化物與土壤中的一些酸性物質(zhì)結(jié)合能形成有利于植物生長的氮肥，從而在種胚發(fā)育過程中起到一定的催芽作用[7]。經(jīng)比較雪藏在提高種子萌發(fā)率方面表現(xiàn)出相對優(yōu)勢，但處理時間較長，需要大約3個月的生理后熟時間，此方法在北方比較常見，尤其是降雪較多的地方應(yīng)該大力推廣。500 mg/L GA3處理組相對萌發(fā)率略低，但只需要20～30 d 即可完成生理后熟，可根據(jù)具體生產(chǎn)實踐要求，選擇最適的處理方法。本研究克服了休眠長、發(fā)芽率低等因素對牛尾菜育種的影響，操作簡單、成本低，能為牛尾菜人工栽培、生產(chǎn)和推廣奠定基礎(chǔ)。

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