金桐 熊曉星

納米微粒搭載傳統(tǒng)藥物可以使后者能在機體復(fù)雜內(nèi)環(huán)境及代謝系統(tǒng)中保持相對穩(wěn)定，并能跨越血腦屏障，在腦卒中病灶穩(wěn)定釋放藥物，從而可以在腦卒中病程較長階段中發(fā)揮診斷、治療和監(jiān)測作用。

腦卒中的發(fā)生難以預(yù)料且癥狀嚴重。目前臨床上對于缺血性腦卒中的治療方法僅有溶栓使血管再通效果顯著，而營養(yǎng)神經(jīng)、抗血管痙攣、降壓、抗凝等治療措施雖然有效，但不能直接對抗腦缺血及再灌注造成的急性腦損傷，而一些在體外實驗中被證實很有潛力的藥物面對機體的復(fù)雜的代謝環(huán)境和屏障作用等障礙難以在臨床實際中投入使用；在診斷方面雖然目前在腦卒中發(fā)病入院后可以利用CT、MRI等傳統(tǒng)影像學(xué)方法快速檢查出梗死部位、體積等，但對于梗死原因的診斷缺乏有效性。由于多種病因共存，診斷直接病因較為困難，常規(guī)的血液學(xué)和生化檢驗并不能準確及時地評估血液成分異常。近些年來，納米材料的興起給腦卒中的診斷和治療提供了更有效的新途徑。

1 血腦屏障和腦卒中

1.1 血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能

血腦屏障由內(nèi)層腦微血管內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞間緊密連接、基底膜和包繞在毛細血管外的周細胞(類似于平滑肌細胞)、星形膠質(zhì)細胞足突及血管周圍巨噬細胞共同構(gòu)成[1]。周細胞可通過自身收縮來控制通過分子的大小，負責(zé)內(nèi)皮細胞囊泡運輸和緊密連接形成，還抑制增加血管滲透性的相關(guān)分子表達[2]。星形膠質(zhì)細胞足突穿插在周細胞間且與基底膜接觸，共同促進內(nèi)皮細胞間緊密連接的形成和維持，并且能增加跨內(nèi)皮細胞電阻(TEER)。緊密連接主要由三種蛋白構(gòu)成，包括跨膜蛋白(含claudin、occludin、連接黏附分子JAM)、胞質(zhì)附著蛋白即閉鎖小帶(Zonula Occludens proteins,ZO-1,2,3)以及細胞骨架蛋白如肌動蛋白。除緊密連接外，還有鈣粘素/鏈蛋白粘附連接復(fù)合體與細胞骨架相連。大腦毛細血管腔側(cè)表達的P-糖蛋白(P-gp)具有ATP依賴性外排泵功能，能降低某些對此蛋白具有親和力的藥物在胞內(nèi)蓄積。正常情況下血腦屏障可以限制絕大多數(shù)小分子和幾乎全部大分子物質(zhì)進入腦組織。

1.2 腦卒中后血腦屏障破壞和繼發(fā)性損傷

發(fā)生腦卒中后血腦屏障嚴重受損，在7 d內(nèi)無法重建正常功能[3]。缺血性腦卒中不僅使血腦屏障緊密連接受到破壞，也會損傷形成和維持血腦屏障的周細胞、星形膠質(zhì)細胞等，連接復(fù)合體上閉合蛋白減少，跨內(nèi)皮細胞電阻減小，血腦屏障通透性增加。其結(jié)果是原本不存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管腔內(nèi)流動成分如中性粒細胞、單核-巨噬細胞、前列腺素等細胞和分子可穿過血管壁離開管腔到達腦組織，促進局部炎癥反應(yīng)，加劇腦水腫，加上局部缺血缺氧、氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細胞毒性作用、凋亡以及外周免疫抑制[4]的發(fā)生，可能導(dǎo)致局部和全身繼發(fā)性損傷[5]。神經(jīng)元壞死和凋亡可以在腦卒中后的幾個月內(nèi)持續(xù)發(fā)生，且會波及到非梗死區(qū)域如海馬、杏仁核、丘腦等，神經(jīng)遞質(zhì)釋放失衡、肺部感染[6]、腦卒中再發(fā)、甚至自身免疫性疾病可能參與到繼發(fā)性損傷過程并導(dǎo)致嚴重疾病如運動障礙和神經(jīng)精神疾病[7-8]。

1.3 當下腦卒中治療方法的局限性

發(fā)生缺血性卒中后幾分鐘內(nèi)梗死區(qū)域細胞主要是神經(jīng)元出現(xiàn)壞死和凋亡，促炎癥細胞如小膠質(zhì)細胞的激活，外周中性粒細胞滲出，釋放多種炎癥因子，造成缺血區(qū)域周圍組織可逆性損傷形成缺血半暗帶，腦梗死中心區(qū)域由于長時間缺血缺氧，組織壞死嚴重難以恢復(fù)，但如果盡早采取有效治療措施(如使血管再通),半暗帶可以恢復(fù)[9]?，F(xiàn)階段治療缺血性腦卒中的藥物療效并不理想，一是因為缺血區(qū)域血流灌注不足，攝入的藥物只有極少量可以到達梗死區(qū)域發(fā)揮作用，而周邊區(qū)域血腦屏障功能正常，亦無法使藥物通過；二是腦卒中時的血腦屏障損傷是可逆的，血腦屏障功能會逐步重建，此過程中藥物將更難到達腦組織；三是通透率低的同時，藥物自身降解以及被機體代謝將無法保證系統(tǒng)的有效藥物濃度。目前藥物通過血腦屏障的成功率為4%～7%[10]。通常血腦屏障允許通過的藥物特點是親脂性小分子。同時應(yīng)用血管舒張藥可以使藥物通透率增加，但這種非選擇性作用亦會讓有害物質(zhì)通過。

目前臨床上真正實現(xiàn)商業(yè)應(yīng)用的藥物只有重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)。rt-PA可使部分血管再通而減輕局部缺血缺氧，但這項治療的有效性高度依賴時間，且如果缺血組織損傷過重，應(yīng)用rt-PA可能會增加出血風(fēng)險[11]?？鼓幬镆部梢杂糜谥委熑毖阅X卒中，但其應(yīng)用僅限于預(yù)防或者懷疑有發(fā)病風(fēng)險時，并不能阻止缺血后病情進展。治療腦卒中的藥物如果要保持其治療的功效，那么在通過血腦屏障時不但要有足夠的量，而且要能夠維持其分子結(jié)構(gòu)。因此，治療缺血性腦卒中理想的藥物須有高度穩(wěn)定性以抵抗機體的自然防御和代謝，同時不產(chǎn)生明顯的細胞毒性而影響機體的正常功能，納米微?？梢詭椭鷮崿F(xiàn)這些。

2 納米微粒的概述

2.1 藥物輸送和納米微粒

目前納米微粒在醫(yī)學(xué)上分為三類，一是金、銀、氧化鋅等無機納米微粒，尺寸介于1～100 nm；二是人工合成的有機高分子材料，包括聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等，尺寸介于10～500 nm，碳量子點(CDs，1～10 nm)因其高生物學(xué)相容性和無毒特性，近來被用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中[12]；第三類是納米脂質(zhì)體(liposomes),尺寸介于400～2 500 nm。血腦屏障的物質(zhì)轉(zhuǎn)運可分為主動途徑和被動途徑。主動式包括三種，一是受體介導(dǎo)的胞吞作用，有機高分子材料大多經(jīng)此途徑；二是吸附后介導(dǎo)胞吞，納米脂質(zhì)體和無機金屬納米微粒可經(jīng)此途徑通過血腦屏障；三是與載體結(jié)合穿越細胞。通過被動途徑轉(zhuǎn)運的主要是一些親脂性的小分子和無機金屬納米微粒，可以通過自由擴散的方式跨越血腦屏障。

納米微粒的厚度和大小可顯著影響療效。囊性納米微粒核心體積表面積比例(以下簡稱體表比)隨著納米微粒尺寸的變化而變化。例如在微粒囊厚度不變的情況下較小尺寸的納米微粒體表比較小，一旦顆粒膜打破藥物可以立即充分釋放；大分子納米微粒載藥較多，但釋放藥物會不均勻、不徹底，故不如小分子納米顆粒，而且如果納米微粒被分解或者藥物被包裹入膠囊隔層，則不能有效輸送和釋放藥物。藥物的釋放時間點和速率也是納米微粒載體有效性的重要指標，過早和過快的釋放可能在藥物到達病灶之前就會由機體代謝和分解，過慢的釋放則難以起到有效的治療作用。在腦卒中的診療方面理想的納米微粒應(yīng)該是能夠高效率跨越血腦屏障，并可以在病灶中長期均勻釋放藥物。

2.2 生物化學(xué)修飾可使納米微粒效能增強

納米微粒的載體作用可通過其包裝或者結(jié)合藥物的功能實現(xiàn)。要增強納米微粒作為藥物載體的運輸能力，可以引入由內(nèi)皮細胞或免疫細胞(如吞噬細胞)識別的表面受體分子，或延長其類脂酸鏈,以增加親脂性[13]，也可以利用生化材料包裹或化學(xué)修飾，或與其它細胞組件或因子(如抗體、多肽、糖蛋白等)結(jié)合，通過前文所述多種途徑而使藥物到靶位。最近研究顯示給納米微粒添加1個聚乙二醇(PEG)高分子聚合物保護層,可以增加納米微粒在循環(huán)系統(tǒng)中存在的時間,也增強了穿越細胞的能力[14]。聚山梨醇酯包被的納米微?？膳c內(nèi)皮細胞表面特定脂蛋白結(jié)合，增強其通過胞吞途徑跨越血腦屏障的能力。針對與血腦屏障相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白是將藥物準確送達中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最好方法之一。例如與不同分子量的聚乙二醇(PEG)結(jié)合的納米脂質(zhì)體(直徑25～1 000 nm)上的膽固醇以葡萄糖修飾后可以被大腦血管內(nèi)皮細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT1識別并介導(dǎo)轉(zhuǎn)運[15]。

多種聚合物的使用相結(jié)合,或與其它類型介質(zhì)結(jié)合，能使有關(guān)藥物輸送和釋放更可控。Nair等[16]將納米脂質(zhì)體與鐵粒子結(jié)合，在磁力的作用下納米脂質(zhì)體穿過血腦屏障的效率增加了50%～100%。Zhang等[17]開發(fā)出一種酵母細胞包裹的載有雷帕霉素的納米材料，經(jīng)口服后可在小腸由M細胞吸收，進入Peyer’s淋巴結(jié)通過淋巴循環(huán)進入血液循環(huán)，由巨噬細胞攝取后可攜帶運送到炎癥反應(yīng)部位如聚集在粥樣斑塊。腦卒中時外周單核-巨噬細胞會進入缺血區(qū)域參與炎癥反應(yīng)，可以用此酵母細胞包裹載有更多類型的藥物來進行“特洛伊木馬”式的治療，本團隊目前正在進行相關(guān)研究工作。

3 腦卒中診斷與納米微粒

得益于近些年對納米材料的研究[13]，藥物釋放時間、納米微粒尺寸、抗降解能力等將不再成為藥物治療缺血性腦卒中的障礙。有體外研究顯示，他汀類藥物或坎地沙坦可以封裝在納米微粒中,通過胞吞作用或跨細胞途徑通過血腦屏障[10,18]。傳統(tǒng)與新興技術(shù)可以結(jié)合，比如用納米微粒搭載帶標記的抗體(抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷生物標志物如S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)、血管細胞黏附分子(VCAM)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP等),用計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)掃描快速檢測出損傷部位和范圍[19]。如果納米微粒有良好的抵抗體液成分分解的能力，可使其與凝血因子結(jié)合以達到對腦血栓形成的早期診斷，甚至破壞導(dǎo)致血栓形成的凝血因子級聯(lián)反應(yīng)[19]。Lin等在納米微粒表面連接了一種凝血酶敏感性多肽，可以檢測血液中凝血酶水平，進而對可能存在的血栓相關(guān)風(fēng)險進行監(jiān)控[20]。

4 腦卒中治療和納米微粒

載藥納米微粒治療效果的實驗性研究、臨床前研究以及早期臨床試驗的歷史并不長。納米材料在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究相比于其它學(xué)科也顯得滯后。Hurtado等[21]將胞苷二磷酸膽堿——一種對再灌注損傷和局部缺血有神經(jīng)保護功能的藥物封裝在適當納米微粒中可以讓藥物通過循環(huán)系統(tǒng)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型中包裹堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或caspase-3抑制劑(z-DEVD-FMK)的殼聚糖納米微?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)鐵蛋白受體-1介導(dǎo)的跨細胞轉(zhuǎn)運途徑大量穿透血腦屏障到達腦組織中，可檢測到梗死側(cè)大腦中動脈灌注區(qū)域血流灌注流失量減少[22]。腺苷是一種具有神經(jīng)藥理活性的藥物，但會在血液中快速代謝和清除，Alice等最近的一項研究表明,鯊烯乙酸和腺苷共價結(jié)合后組裝成鯊烯腺苷(SQAd)納米藥物在血液中可以保持穩(wěn)定狀態(tài)，在給大鼠腹腔注射用藥后1h血液中有85%，2～4 h穩(wěn)定保持在70%[23]。最近的研究表明,某些納米微?？梢宰鳛榛钚匝?ROS)清道夫。這些活性氧族在腦缺血期間增加,特別是在再灌注后。納米微粒的使用并不局限于封裝的藥物或與表面受體結(jié)合。體內(nèi)實驗證實鉑納米顆粒具有清除超氧化物陰離子和過氧化氫的能力[24]。二氧化鈰納米微粒具有同樣的清除屬性，鈰由還原態(tài)變?yōu)檠趸瘧B(tài)的過程,類似于生物體抗氧化方式。這些納米微粒尺寸更細微(小于10 nm)，有作為藥物治療腦缺血再灌注損傷的潛力。

5 結(jié)束語

現(xiàn)階段作為治療腦卒中藥物載體的納米顆粒仍在研發(fā)和研究當中，尚存在諸多問題。一個難點是納米顆粒釋放藥物的速度還不能穩(wěn)定掌控。因納米材料尺寸越大，效率越低，大分子納米材料可能既不被靶位組織吸收，又會在合成過程中覆蓋識別受體分子。要想增加通過血腦屏障的藥物量，可以增加載藥納米顆粒的量，同時劑量增加可能造成對細胞毒性作用增強。目前已有對于納米微粒毒性的報道，M.Koltereta等對聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)納米微粒進行的毒性實驗表明，在納米微粒濃度≤500 μg /mL時，對細胞生存狀態(tài)無影響，不會引起大鼠血液炎癥因子表達增多和器官損害，在對人血液12項炎癥因子的檢測中僅有IL-8一項釋放增多[26]。此外，另一種成熟納米微粒PLGA/PLA及其復(fù)合多聚物的安全性及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病療效的實驗成果已有諸多文獻證明[27]。前文已經(jīng)提到多種方法提高載藥納米微粒的診斷或治療效果，包括引入表面受體、調(diào)整尺寸、以PEG或其它高分子材料被覆、結(jié)合凝血標志物、以抗體標記等。未來應(yīng)進一步優(yōu)化納米顆粒的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等參數(shù)，使其成為低副作用的高效藥物載體。

腦卒中是一種對時間很敏感的疾病，早期診斷和治療的時間決定著患者的預(yù)后。不幸的是，卒中的治療局限多且時間窗口窄。腦卒中后血腦屏障通透性增強的7 d窗口期有利于輸送藥物，但這并不足夠。一種真正有效的神經(jīng)保護藥物必須能有效通過血腦屏障，在血腦屏障功能逐漸恢復(fù)或完好時到達病灶起作用，也要能克服外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其它障礙。治療時應(yīng)全面考慮急性期和慢性期、初始的和可能繼發(fā)的神經(jīng)損傷。納米顆粒研究的進步將會使其成為腦卒中的診斷、治療工具甚至兼具兩者功能，從而更好地應(yīng)用到臨床實踐中。