楊銀菊，張彥，王樹聲，劉光亮，許娜，王程棟，周培祿，陳愛國

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

多酚類物質(zhì)是植物中苯丙烷代謝途徑重要的代謝產(chǎn)物。煙草葉片中主要的多酚類化合物為綠原酸、蕓香苷和莨菪亭，其中綠原酸和蕓香苷含量較高，可占總酚含量的75％～95％[1-2]，其含量與煙草品質(zhì)形成密切相關(guān)[3-4]，可提高煙草植株應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)的抗逆性和抗氧化性[5-6]。

打頂是煙草栽培過程中一項(xiàng)重要的農(nóng)藝措施，對(duì)于烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)形成具有重要作用[7]。由于打頂去除了煙株頂端生長點(diǎn)，改變了煙株的源庫關(guān)系，因此次生代謝和激素代謝等多個(gè)生物學(xué)過程都會(huì)發(fā)生變化[8]。打頂可以顯著提高煙堿[9]和芳香胺[10]等次生代謝物的含量，同時(shí)也導(dǎo)致與激素代謝和機(jī)體防御有關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)[11]。前人研究表明，紅花大金元品種的多酚類物質(zhì)含量高[12]，是研究打頂誘導(dǎo)多酚積累的理想材料。前人研究了綠原酸等多酚類物質(zhì)含量在打頂后的變化[13-14]，但目前打頂對(duì)煙草多酚類物質(zhì)合成及調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道。本研究以紅花大金元為試驗(yàn)材料，探討不同時(shí)期打頂對(duì)煙葉中多酚類物質(zhì)合成及其關(guān)鍵酶活性的影響，同時(shí)結(jié)合qRT-PCR分析了多酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量差異，旨在揭示打頂誘導(dǎo)多酚類化合物生物合成的調(diào)控機(jī)制，以期為定向提高烤煙品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為紅花大金元。紅花大金元種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所國家煙草種質(zhì)資源中期庫提供，經(jīng)浸泡、滅菌、消毒后于28℃黑暗條件下催芽，沙培45d后進(jìn)行移栽。盆栽試驗(yàn)于2016年9月20日至12月29日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室內(nèi)進(jìn)行，苗期日平均溫度為25±1℃，現(xiàn)蕾到打頂期日平均氣溫25±1℃，盆高20cm，直徑25cm，每盆裝土8kg，基質(zhì)(腐殖酸含量≥5.0％，有機(jī)質(zhì)含量≥25.0％)與土(棕壤，有效氮、磷、鉀含量分別為97.29mg/kg、8.84mg/kg、216.98mg/kg)1:1(v/v)混勻后裝盆，每盆種植1株煙。

1.2 試驗(yàn)處理

分別在苗期(八葉一心期)和現(xiàn)蕾后10d(移栽后85d)設(shè)置打頂處理和不打頂處理，分別以同期不打頂處理為對(duì)照。每個(gè)處理種植25株；苗期打頂處理采用刀片將幼嫩的未展開葉片及以上莖頂端組織切除，現(xiàn)蕾后打頂處理于50％第一中心花開放時(shí)切除莖頂端(留葉18片)。

打頂后第1、3、6、9和12d，每處理分別選取3株生長正常一致的中部葉(苗期第4葉位，現(xiàn)蕾后10d第8葉位)，作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；去除主脈后煙葉置于液氮中速凍，保存于-80℃超低溫冰箱中?；蚨糠治霾捎么蝽敽蟮?d樣品，酶活檢測采用打頂后第1、3d的樣品，多酚檢測采用打頂后第1、3、6、9、12d 的樣品。

1.3 測定方法

1.3.1 多酚類物質(zhì)含量測定

參照YC/T 202-2006行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[15]，用高效液相色譜法(HPLC)測定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量。

1.3.2 酶活性測定

采用紫外分光光度法利用PAL活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性，參照Kong[16]的方法利用酶標(biāo)儀測定肉桂酸4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酸連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)活性。采用酶聯(lián)免疫法(江蘇科晶生物技術(shù)有限公司)測定多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)及表達(dá)量測定

根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計(jì)的要求，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。以Actin為內(nèi)參基因[17]，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因相對(duì)定量分析[18]。

表1 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.1軟件進(jìn)行LSD多重比較法方差分析(P＜0.05)，Excel和Origin 9.1軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期打頂對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響

2.1.1 苗期打頂對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響

由圖1可知，打頂處理后1～12d內(nèi)，打頂處理后煙葉中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。除新綠原酸含量在打頂后第9d高于對(duì)照外，其余同期打頂處理后煙葉中多酚類物質(zhì)含量均低于對(duì)照。

在打頂后第1d時(shí)，打頂處理煙葉多酚類物質(zhì)含量與對(duì)照無顯著差異，在打頂后第3d，打頂處理煙葉中多酚類物質(zhì)含量除蕓香苷外均顯著低于對(duì)照，依次降低20.89％、16.56％和19.23％；在打頂后第6d，打頂處理的煙葉中4種酚類化合物與對(duì)照相比依次降低31.6％、13.24％、13.96％和10.75％，但除綠原酸外差異均不顯著；在打頂后第9d，打頂處理的煙葉中新綠原酸含量顯著高于對(duì)照，其它多酚類物質(zhì)含量沒有差異；在打頂后第12d，打頂處理煙葉中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量均顯著低于對(duì)照，依次降低12.24％、17.07％、14.42％和14.67％。

圖1 苗期打頂對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of topping on the content of polyphenols in tobacco leaves at the seedling stage

2.1.2 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，打頂處理后1～12d內(nèi)，煙葉中4種多酚類物質(zhì)含量變化表現(xiàn)出相似的規(guī)律，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中在打頂后第1d時(shí)，打頂處理煙葉多酚類物質(zhì)含量與對(duì)照無顯著差異，在打頂后第3d時(shí)，煙葉多酚類物質(zhì)含量均最高，在打頂后3～9d急劇下降，在打頂后第9～12d時(shí)略微升高。同時(shí)，打頂處理的煙葉中4種多酚類物質(zhì)含量在整個(gè)取樣時(shí)間內(nèi)均高于對(duì)照。

在打頂后第3d時(shí)，打頂處理煙葉中4種多酚類物質(zhì)含量與對(duì)照相比均呈現(xiàn)顯著性差異，依次升高60.79％、24.28％、59.27％和33.39％；在打頂后第6d時(shí)，打頂處理煙葉中綠原酸含量與對(duì)照相比呈現(xiàn)顯著差異，升高37.61％，其他3種物質(zhì)含量與對(duì)照相比差異均不顯著；打頂后第9d時(shí)，打頂處理煙葉中綠原酸、隱綠原酸含量與對(duì)照無顯著差異，其他3種酚類化合物含量均高于對(duì)照，但隱綠原酸含量未達(dá)到顯著差異水平。

圖2 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of topping on the content of polyphenols in tobacco leaves after the flower-bud appeared

2.2 不同時(shí)期打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1 苗期打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶活性的影響

由圖3可知，打頂后第1d時(shí)，打頂處理的煙株葉片中PAL活性顯著高于對(duì)照，C4H略高于對(duì)照，但差異不顯著，4CL活性顯著低于對(duì)照；打頂后第3d時(shí)，打頂處理煙株葉片中4CL活性顯著高于對(duì)照，PAL和C4H活性與對(duì)照無顯著差異。

圖3 苗期打頂對(duì)煙葉多酚合成關(guān)鍵酶活性的影響Fig.3 Effects of topping on the activity of key enzymes on the process of polyphenols synthesis in tobacco leaves at the seedling stage

2.2.2 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶活性的影響

由圖4可知，打頂處理后1～3d內(nèi)，煙株葉片中C4H和4CL活性呈現(xiàn)升高趨勢，并且在打頂后第3d時(shí)，打頂處理煙株葉片中二者的活性均顯著高于對(duì)照。打頂處理煙株葉片中PAL活性在打頂后第1d和第3d均顯著高于對(duì)照，但隨打頂時(shí)間的推進(jìn)呈現(xiàn)下降趨勢。

圖4 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚合成關(guān)鍵酶活性的影響Fig.4 Effects of topping on the activity of key enzymes on the process of polyphenols synthesis in tobacco leaves after the flower-bud appeared

2.3 不同時(shí)期打頂對(duì)煙葉多酚降解關(guān)鍵酶活性的影響

2.3.1 苗期打頂對(duì)煙葉多酚降解關(guān)鍵酶活性的影響

由圖5可知，打頂后1～3d內(nèi)，煙株葉片PPO活性呈現(xiàn)升高的趨勢，其中打頂后第3d出現(xiàn)顯著增加，而POD活性則在打頂后1d出現(xiàn)顯著增加。

圖5 苗期打頂對(duì)煙葉多酚降解關(guān)鍵酶活性的影響Fig.5 Effects of topping on the activity of key enzymes on the process of polyphenols degradation in tobacco leaves at the seedling stage

2.3.2 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚降解關(guān)鍵酶活性的影響

由圖6可知，打頂后1～3d內(nèi)，煙株葉片PPO活性呈現(xiàn)下降趨勢，其中打頂后第3d出現(xiàn)顯著降低，而POD活性則在打頂后1d出現(xiàn)顯著增加。

圖6 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙草葉片多酚降解關(guān)鍵酶活性的影響Fig.6 Effects of topping on the activity of key enzymes on the process of polyphenols degradation in tobacco leaves after the flower-bud appeared

2.4 煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

2.4.1 苗期打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

由圖7可知，打頂后1d內(nèi)，打頂處理煙葉中PAL家族4個(gè)成員均上調(diào)表達(dá)，其中，與不打頂處理相比PAL1、PAL2、PAL3和PAL4表達(dá)量顯著上調(diào)，分別上調(diào)2.6倍、2.6倍、2.7和1.8倍。打頂處理煙株葉片C4H、4CL1、HCT(hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase，羥基肉桂酰輔酶A編碼基因)和HQT(hydroxycinnamoyl-CoA:quinate hydroxycinnamoyl transferase，羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因)表達(dá)量上調(diào)幅度比較大，分別上調(diào)3.9、4.7、5.4、4.6倍。

圖7 苗期打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of topping on the expression of polyphenols biosynthetic key enzyme genes in tobacco leaves at the seedling stage

2.4.2 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

由圖8可知，打頂后1d內(nèi)，打頂顯著上調(diào)PAL2、PAL3、C4H、4CL1和C3H基因的表達(dá)，其中PAL2和PAL3上調(diào)幅度最大；打頂處理的煙株葉片PAL4、4CL2和HQT基因表達(dá)水平與對(duì)照相當(dāng)；PAL1表達(dá)顯著下調(diào)。

圖8 現(xiàn)蕾后打頂對(duì)煙葉多酚生物合成關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of topping on the expression of polyphenolsbiosynthetic key enzyme genes in tobacco leaves after the flowerbud appeared

3 討論

3.1 不同時(shí)期打頂對(duì)煙葉多酚合成的影響

低溫、機(jī)械損傷、紫外線、光照等環(huán)境脅迫誘導(dǎo)了植物體內(nèi)多酚類物質(zhì)的生物合成[12,19-21]。在煙草上，打頂是多酚快速積累的重要誘導(dǎo)因素之一，然而，從打頂?shù)慕嵌葋硌芯慷喾雍铣纱x未見報(bào)道。本研究探討了不同時(shí)期打頂后多酚的動(dòng)態(tài)變化趨勢，同時(shí)對(duì)多酚合成和降解關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明苗期打頂后，煙葉中多酚類物質(zhì)含量在打頂后第3d時(shí)顯著低于對(duì)照，之后呈逐漸上升的趨勢；現(xiàn)蕾后打頂處理可以短暫的提高煙葉多酚類物質(zhì)含量，之后隨生育期的推進(jìn)多酚呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，這與袁衛(wèi)瑜等[13]的研究結(jié)果一致。不同時(shí)期打頂后煙葉多酚含量表現(xiàn)出相反的規(guī)律，其中除了打頂這一主要影響因素外，還涉及煙株自身生長發(fā)育的影響、外界環(huán)境因素的影響。本實(shí)驗(yàn)是在溫室條件下進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)穩(wěn)定。但是由于實(shí)驗(yàn)周期長，因此不能排除打頂與溫度等其他因素互作。楊慧芹等[22]研究發(fā)現(xiàn)在移栽-團(tuán)棵期，處理的前20d內(nèi)均溫20℃和均溫16℃處理的總酚含量均顯著低于均溫18℃的處理，而團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期，溫度越低多酚積累量越少，說明不同時(shí)期煙葉多酚積累的最適溫度具有差異性，但是楊慧芹等[22]研究中不同生育期所設(shè)定溫度不一樣(移栽-團(tuán)棵期為20、18和16℃，團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期為21、23和25℃)，不能說明不同時(shí)期煙葉多酚含量對(duì)溫度的響應(yīng)具有差異性。而目前還沒有苗期打頂方面的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，因此在后續(xù)研究中還應(yīng)深入研究溫度、生育期等影響因素是否與打頂互作從而造成不同時(shí)期煙葉多酚含量對(duì)打頂?shù)牟町愴憫?yīng)，最終鎖定關(guān)鍵因子，解析不同時(shí)期打頂后煙葉多酚含量差異響應(yīng)的影響機(jī)制。

3.2 打頂對(duì)煙葉多酚合成的調(diào)控機(jī)制

PAL是苯丙烷代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶。各種環(huán)境因素包括病原物侵染、組織損傷、紫外線照射、重金屬污染、低溫和低氮、低磷都會(huì)使PAL活性上升[23]。楊慧芹等[24]研究發(fā)現(xiàn)干旱處理下PAL活性與總酚含量的變化保持一致，低溫處理后雖然總酚含量持續(xù)下降，但PAL活性升高，其基因表達(dá)量在脅迫初期也快速上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，苗期打頂處理煙葉中多酚類物質(zhì)含量下降，PAL活性升高，PPO和POD活性顯著增加；現(xiàn)蕾后打頂處理多酚類物質(zhì)含量升高，PAL活性升高，POD活性增加低于苗期打頂處理，PPO活性在不打頂處理中活性顯著增加。因此，多酚類物質(zhì)含量在不同時(shí)期打頂后的相反的表現(xiàn)，與多酚降解酶的調(diào)控密切相關(guān)。

4CL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，調(diào)控苯丙烷途徑碳代謝流的方向，對(duì)植物生長發(fā)育起重要作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)低溫[22]和干旱[24]脅迫下4CL活性達(dá)到最高時(shí)，多酚類物質(zhì)含量也達(dá)到最高。本研究結(jié)果也表明，打頂后4CL的活性與多酚類物質(zhì)含量變化趨勢一致，苗期打頂后4CL活性降低，多酚類物質(zhì)含量也降低，現(xiàn)蕾后打頂處理4CL活性較高，多酚類物質(zhì)含量也較高。

煙株在正常生長發(fā)育過程中葉片多酚類物質(zhì)含量隨生長和成熟度的增加而增加，在煙葉達(dá)到生理成熟后開始下降，并且受打頂措施調(diào)控[13,26-28]。本研究不同時(shí)期打頂?shù)膶?shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了此現(xiàn)象。苗期打頂處理能顯著降低煙葉中綠原酸等多酚的含量，而現(xiàn)蕾后打頂處理能顯著提高煙葉多酚類物質(zhì)含量，說明打頂誘導(dǎo)多酚生物合成與應(yīng)激反應(yīng)無關(guān)，除了受機(jī)械損傷誘導(dǎo)外，還與生育期有關(guān)。

煙草PAL基因家族由4個(gè)成員組成，其中PAL1和PAL4分為一個(gè)亞家族，PAL2和PAL3分為一個(gè)亞家族[29]。本研究表明，PAL2、PAL3在不同時(shí)期打頂均表達(dá)上調(diào)，與PAL活性變化一致，說明打頂誘導(dǎo)了PAL2、PAL3基因表達(dá)，從而增強(qiáng)了PAL活性。煙草4CL家族有兩個(gè)成員[24]，苗期打頂后，4CL1和4CL2表達(dá)均顯著上調(diào)，其中4CL1上調(diào)幅度較大；現(xiàn)蕾后打頂，僅4CL1表達(dá)顯著上調(diào)，說明打頂誘導(dǎo)了4CL1的上調(diào)表達(dá)，但多酚類物質(zhì)含量的變化及4CL的活性并不與4CL1的基因表達(dá)水平一致，其調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

苗期和現(xiàn)蕾后兩個(gè)時(shí)期打頂后煙葉PAL、POD活性均升高，其中現(xiàn)蕾后打頂處理煙葉POD活性增加低于苗期打頂處理，而煙葉多酚類物質(zhì)含量和PPO活性在兩個(gè)時(shí)期打頂后呈現(xiàn)相反的變化。因此，打頂誘導(dǎo)煙葉多酚合成與生育期及多酚降解酶的調(diào)控密切相關(guān)。

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