李冠英， 李海紅， 徐士勛， 潘曉雨

(上海華新生物高技術有限公司，上海 201206)

白細胞介素-2(Interleukine-2，IL-2)，是由白細胞分泌的一種糖蛋白，可介導細胞間的相互作用，在細胞的活化、增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用[1]。IL-2是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中的核心物質(zhì)，與其他細胞因子有協(xié)同和拮抗作用，共同完成機體免疫機能的平衡調(diào)節(jié)作用[2]；IL-2能刺激NK細胞、CTL、LAK細胞的活化和增殖，也能促使T淋巴細胞、NK細胞產(chǎn)生干擾素、腫瘤壞死因子等[3]。所以IL-2作為一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，在抗病毒、抗細菌感染和抗腫瘤等治療中被廣泛應用[4]。目前，IL-2在臨床上已被廣泛應用于腫瘤、免疫缺陷和感染性疾病的治療，并取得了顯著的效果，如臨床乙肝、腎癌及黑色素瘤的治療[5-8]。IL-2的廣泛臨床應用帶來的效益，使不少樣品生產(chǎn)廠家紛紛進入這一領域[9-10]。為獲得重組人白細胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)，普遍使用的策略是構建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達rhIL-2。

rhIL-2以大腸桿菌作為宿主表達雖然取得了很大成功，但是其表達形式為包涵體，獲得具有生物活性的rhIL-2，需要后續(xù)變性、復性等復雜的一系列步驟[11]；而rhIL-2的變復性效率極低，這就成了工業(yè)化生產(chǎn)的一個瓶頸，嚴重限制了工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。使用可溶表達策略，直接表達可溶性的rhIL-2成了現(xiàn)階段的一種訴求。

麥芽糖結(jié)合蛋白(maletose-binding protein，MBP)，是E.coli中主要負責麥芽糖攝取和分解的蛋白質(zhì)[12]；現(xiàn)有研究表明MBP與外源蛋白融合時，具有強烈的助溶作用，可以顯著提高與之融合的外源蛋白的可溶表達[13-14]。

本研究小組利用基因重組技術將rhIL-2融合在MBP的C端，構建pMAL-c2x-rhIL2表達載體；通過 BL21(DE3)宿主菌進行表達最終經(jīng)過分離純化及裂解得到可溶性的rhIL-2。

1 材料與方法

1.1 材料

il-2由南京金斯瑞生物科技公司合成；菌種DH5α、BL21(DE3)均由江蘇大學譚小力教授惠贈；載體pMAL-c2X購于NEB(New England Biolabs)公司，DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司。DNA連接試劑盒、IPTG、DNA marker 均購于大連寶生物工程有限公司等；限制性內(nèi)切酶、Amylose樹脂、Factor Xa蛋白酶購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根據(jù)il-2序列設計特異性引物， 交于上海生工生物合成；序列如下:上游引物rhIL2-F:5′CATATGGCACCTACTTCAAGTTC 3′(下劃線部分為NdeI位點)；下游引物rhIL2-R: 5′ GGATCCCCCCTGATATGTTTTAA 3′(下劃線部分為BamH I位點)。

1.2.2 目的基因的擴增與純化

反應體系：模板0.2 μL；引物rhIL2-F,rhIL2-R (10 μmol/L)各2.5 μL；ExTaq(5 U/μL) 0.2 μL；dNTP mixture(各2.5 mmol/L)5 μL；10×PCR Buffer 5 μL，加ddH2O至50 μL；擴增反應條件：94℃預變性10 min；94℃變性45 s，56.0℃退火45 s，72℃延伸50 s，共36個循環(huán)；72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳，將目的條帶進行割膠，用DNA回收試劑盒回收純化。

1.2.3 克隆載體rhIL2-T的構建與鑒定

PCR回收產(chǎn)物進行TA克隆(步驟按照 pMD19T 載體說明書)，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，于含有0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上涂布，挑選單菌落，進行PCR鑒定，將陽性克隆送上海生工生物進行測序。

1.2.4 表達載體rhIL2-pMAL-c5x的構建與鑒定

測序正確的rhIL2-T陽性克隆，提取質(zhì)粒并和表達載體分別進行雙酶切，50 μL體系如下:BamH I 1.0 μL、NdeI 1.0 μL，10×Cutsmart Buffer 5 μL，質(zhì)粒10 μL，加ddH2O至50 μL。雙酶切產(chǎn)物PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳，將目的條帶進行割膠，用DNA回收試劑盒回收純化，DNA連接試劑盒16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)，挑選單菌落，進行PCR鑒定，將陽性克隆送上海生工生物進行測序。

1.2.5 重組子的誘導表達及定位分析

將測序正確的轉(zhuǎn)化子，于液體LB中過夜活化，1∶100(V/V)接種于50 mL 2×YT液體培養(yǎng)基中(含0.1 mg/mL氨芐青霉素)，37℃搖床培養(yǎng)至OD600=0.5～0.8;加入誘導劑IPTG,使其終濃度為1 mmol/L；分別于不同條件下培養(yǎng)(A: 37℃搖床培養(yǎng)4 h; B： 25℃搖床培養(yǎng)6 h)；離心收集菌體，棄上清，菌體用ddH2O洗滌2次，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將誘導后收集的菌體，懸浮于20 mL 平衡Buffer(0.1mol/L NaCl,2 mmol/L CaCl2,20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)中；樣品置于冰上，超聲破碎儀中破碎，條件為工作5 s,停止10 s,共30 min;鏡檢90% 以上細胞破碎；破碎后樣品，取50 μL留樣作為總蛋白SDS-PAGE檢測；剩余樣品12 000 r/min,30 min；取出上清，作為可溶蛋白， SDS-PAGE檢測；沉淀懸浮于20 mL(等體積) 20 mmol/L PB(pH 7.0)中，作為不可溶蛋白， SDS-PAGE檢測。

1.2.6 融合蛋白的純化及裂解

將2 mL Amylose樹脂裝于重力流柱管中，5體積ddH2O洗滌，5體積平衡Buffer平衡柱，將細胞破碎后的上清上柱，5體積平衡Buffer洗柱，用15 mL含50 mmol/L麥芽糖的平衡Buffer洗脫并收集洗脫液(每1 mL收集1管，連續(xù)收集) ；洗滌柱并保存于20%的乙醇。

將純化后的MBP-rhIL2，按1∶50(W/W)加入Factor Xa蛋白酶，23℃孵育6 h進行裂解，SDS-PAGE檢測。

1.2.7 生物學活性分析

IL-2依賴性細胞株CTLL-2在不同的IL-2濃度下，表現(xiàn)出生長、死亡等不同的生長狀態(tài)，另外活細胞可將MTT攝入，并在線粒體中琥珀酸脫氫酶的作用下，將黃色的MTT分解成一種藍紫色結(jié)晶——甲瓚，甲瓚溶解后在570 nm處有最大光吸收。在一定的濃度范圍內(nèi)，IL-2的濃度與吸光值呈線性關系，根據(jù)在不同IL-2的濃度下，其細胞依賴株CTLL-2細胞存活率不同，以此檢測IL-2的生物學活性。根據(jù)2015版《中國藥典》第三部，“重組人白介素-2生物學活性測定法”一節(jié)，測定rhIL-2生物學活性。

實驗過程：CTLL-2細胞用完全培養(yǎng)液(1 mL成分：胎牛血清0.1 mL，RPMI1640培養(yǎng)液0.9 mL,400 U IL2)于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)至足夠量，離心收集CTLL-2細胞，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于基礎培養(yǎng)液中配制成每l mL含6.0×105個細胞的細胞懸液，37℃，5% CO2條件下備用。在加有標準品溶液和供試品溶液的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液50 μL，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)18～24 h；然后每孔20 μL加入MTT溶液，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)4～6 h；每孔加人裂解液15 μL，于37℃，5% CO2條件下保溫18～24 h。以上操作均在無菌條件下進行?；靹蚣毎逯械囊后w，放入酶標儀，以630 nm為參比波長，在波長570 nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理，并按下式計算結(jié)果：

待測品生物學活性(IU/mL)=Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

式中：Pr為標準品生物學活性，IU/mL；Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效量的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子優(yōu)化與載體構建

2.1.1 密碼子優(yōu)化

il-2序列是基于GenBank(LOCUS：NM_000586)，去掉信號肽序列，在保證氨基酸序列不變的情況下，考慮mRNA二級結(jié)構自由能及穩(wěn)定性、影響表達的基序等，替換并使用E.coli中偏愛密碼子優(yōu)化基因序列(圖1)然后進行全基因合成。

圖1 rhIL-2基因序列優(yōu)化前后對比

2.1.2 目的基因的擴增

以含優(yōu)化后il-2的質(zhì)粒為模板，rhIL2-F和rhIL2-R 為引物，進行 PCR擴增。結(jié)果如圖2，在450 bp 左右有一條帶，大小與預計相符。

圖2 rhIL-2 基因 PCR擴增

M: DL5000 DNA Marker；1,2：rhIL-2 基因

2.1.3 克隆載體rhIL2-T的構建與鑒定

以rhIL2-F和rhIL2-R 為引物，挑取平板上單菌落為模板，進行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖電泳，可見在450 bp處有明顯條帶，表明il-2已成功連接到 T 載體(圖3) 。

2.1.4 表達載體rhIL2-pMAL-c5X的構建與鑒定

以rhIL2-F和rhIL2-R 為引物，挑取平板上單菌落為模板，以rhIL2-T質(zhì)粒為陽性對照，以不加任何模板為陰性對照，進行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，可見在450 bp處有明顯條帶，陰性對照無任何條帶，表明il-2已成功連接到pMAL-c5X載體(圖4)。

2.2 MBP-rhIL2誘導表達及定位分析

rhIL2-pMAL-c5X BL21(DE3)轉(zhuǎn)化子分別在37℃、4 h和25℃、6 h條件下添加1 mmol/L IPTG誘導，菌體超聲破碎后進行SDS-PAGE檢測。結(jié)果(圖5)顯示，37℃誘導后，有20%的MBP-rhIL2表達且為可溶，在56 ku處與預期大小一致。而在25℃條件下誘導，僅有少量目的蛋白表達?？梢?，37℃是MBP-rhIL2的較佳表達溫度。

圖3 rhIL2-T轉(zhuǎn)化子Pcr鑒定

M: DL5000 DNA Marker；-：陰性對照；1～4：rhIL2-T轉(zhuǎn)化子鑒定

圖4 rhIL2-pMAL-c5X轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

M: DL5000 DNA Marker；+：陽性對照；-：陰性對照；1～5：rhIL2-pMAL-c5X轉(zhuǎn)化子鑒定

圖5 MBP-rhIL2誘導表達及定位分析

M：蛋白marker；CK：未誘導對照；T：誘導后總蛋白；S：誘導后可溶蛋白；I：誘導后不溶蛋白。圖中箭頭所指處為MBP-rhIL2融合蛋白

2.3 MBP-rhIL2的純化及裂解

將誘導后的可溶蛋白，緩慢流過Amylose樹脂柱，通過MBP與樹脂結(jié)合，分離MBP-rhIL2。結(jié)果如圖6所示，Amylose樹脂能有效地純化MBP-rhIL2。

將純化后的蛋白混合，利用Factor Xa蛋白酶將MBP-rhIL2經(jīng)過23℃，6 h孵育后， rhIL2完全被釋放，如圖7所示。

圖6 MBP-rhIL2純化后SDS-PAGE分析

圖7 MBP-rhIL2 裂解分析

2.4 rhIL2生物學活性分析

采用IL-2依賴型細胞株CTLL-2，以標準品IL-2為對照，對裂解后的rhIL-2進行了生物學活性測定。結(jié)果顯示，重組rhIL-2和標準品IL-2一樣，可以有效刺激CTLL-2細胞的增殖(圖8)，說明本研究表達并純化到的rhIL-2具有生物學活性。另外根據(jù)分子量可知rhIL-2占融合蛋白的27%，經(jīng)計算裂解后的rhIL-2比活性為4.4×106IU/mg。

3 結(jié)論

本研究構建了表達載體rhIL2-pMAL-c5x，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在37℃，1mol/L IPTG條件下經(jīng)誘導后，融合蛋白有20%的表達量，且為可溶性表達；通過Amylose樹脂，融合蛋白能夠很便利地被純化出來；進一步利用Factor Xa蛋白酶進行裂解融合蛋白， rhIL-2能夠成功釋放，并具有4.4×106IU/mg的比活性。本研究為rhIL-2在大腸桿菌中的可溶性表達及工業(yè)放大生產(chǎn)提供了依據(jù)。

圖8 rhIL2生物學活性測定

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