張楊+陳虹君+龍歡+楊開勇

摘 要：考古遺址留存下來的人類、動物遺骨遺骸和植物殘留是古代生物信息的載體，為我們提供了重要的基因信息。文章概述了幾種古DNA提取常用的方法及原理，并介紹了這些方法在古DNA研究中的一些應用實例。

關鍵詞：考古；遺?。还臘NA；提取方法

我國墓葬、考古遺址中經常發(fā)掘出土大量豬、馬、牛、羊等動物遺骨遺骸、古尸以及植物殘留[1-6]，這些遺存為我們提供了古代動物、植物和人類重要的基因信息。古DNA是古代生物的信息載體，作為分子生物學研究的一個工具，在建立DNA動力學模型、探索環(huán)境改變與生物多樣性的關系、詳述滅絕動物的飲食、驗證過去群落結構和基因流動障礙、表現生物兩性的特性、推斷古代和現代人類傳播模式、澄清系統發(fā)育關系、闡明進化發(fā)育生物學等方面已經得到了廣泛的應用[7-11]。古DNA對考古學、古生物學以及人類學科具有深遠的影響，對于研究物種的起源與進化具有重要意義。文章闡述了幾種提取古DNA的主要方法及原理，并列舉了一些應用實例。

1 DNA提取的主要方法

1.1 Chelex-100法

原理：當檢材比較少時或者基因分型僅需要少量的DNA時，可用Chelex-100提取方法來提取DNA。Chelex-100由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成，是一種螯合樹脂，含有亞氨基二乙酸鹽離子，可以整合多價金屬離子，且比一般的離子交換劑具有更強的金屬離子選擇性和較高的結合力，可螯合鎂離子、鈣離子等核酸必需的金屬陽離子，防止DNA降解。在低離子強度、堿性及煮沸的條件下，可使細胞膜破裂，并使蛋白質變性，且結合其他有可能會影響進一步分析的外源物質。經過離心，除去了Chelex-100顆粒，同時使得與DNA結合在Chelex-100上的物質分離，保證了下一步的PCR反應，DNA分析也不受抑制劑的干擾[12]。

方法：以血液DNA提取為例。取微量血液用約400μl純水震蕩破碎紅細胞；13，000r/min離心去上清，收集沉淀；向沉淀中加入200μl5% Chelex-100溶液（使用前要充分振搖），在振蕩器上反復振蕩，放入56°C保溫30min以上；取出后振蕩混勻，100℃保溫8min，振蕩后，13，000r/min離心3min，上清用于PCR擴增，或放4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

應用：Chelex-100法適用于血跡、混合斑、毛根、尸骨等生物檢材。整個提取過程只需在一個離心管里進行，大大減少實驗中污染的可能性，且操作簡便，耗時短，成本低廉。由于使用這種方法提取出來的DNA純度不太高，且不適合長期保存，所以在實驗室科研中該方法應用較少。

1.2 酚仿抽提法

原理：苯酚使蛋白質變性，且抑制DNase的降解，但是苯酚會微溶于水。氯仿不溶于水，且苯酚易溶于氯仿，所以可以有效去除苯酚，而且還可以萃取出其他脂類雜質。異戊醇可以減少蛋白質變性過程中產生氣泡，而且還有助于不同溶質相的分離，使離心后上層含有DNA的水相、中間變形蛋白相及下層有機溶劑相保持穩(wěn)定。所以一般酚仿抽提法首先用苯酚抽提，再用25∶24∶1的苯酚-氯仿-異戊醇抽提，最后為了徹底去除苯酚（苯酚對PCR擴增有強烈的抑制作用），采用24：1的氯仿-異戊醇抽提一次，然后用異丙醇或乙醇沉淀DNA。

方法：先用細胞裂解液和蛋白酶K消化樣品，取上清，加入等體積Tris-飽和酚，緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min，再取上清，加入等體積的25∶24∶1的苯酚-氯仿-異戊醇，緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min，再取上清，加入等體積的24：1的氯仿-異戊醇，緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min，加入0.6～1倍體積異丙醇緩慢搖至沉淀出白色的DNA，4℃低溫12000rpm/min離心5min，棄上清留下DNA沉淀，加入75%乙醇洗滌DNA沉淀，再次離心去上清洗滌DNA，最后離心取上清，留下DNA沉淀，空氣中放置揮發(fā)干凈乙醇，加入60～100?L水溶解DNA。

應用：苯酚氯仿法可以用來提取各種生物的各種組織細胞的DNA，是提取DNA最常用的方法，方法步驟雖然不一，但這種技術對于高質量DNA提取是十分有效的。但是在提取古DNA過程中，一些色素物質在沉淀DNA時會一起沉淀，這些物質一般都是PCR反應中DNA聚合酶的抑制劑，會影響之后的PCR擴增效率。而且實驗過程中需反復萃取，每一步都有DNA的損失，要求實驗樣品有較高的DNA含量。另外，苯酚、氯仿是有機溶劑，對人體和環(huán)境影響較大。因此，現在古代生物樣品的DNA提取通常不采用苯酚氯仿法。

1.3 堿裂解法

原理：堿裂解法提取質粒DNA是根據染色體DNA與質粒DNA在變性和復性上的差異來達到分離它們的目的。在pH為12.6的強堿溶液里，染色體DNA的堿基之間的氫鍵會斷裂，使DNA雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的堿基之間的大多數氫鍵也會斷裂，但是超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈是不會完全分離的[13]，當以pH為4.8的NaAc緩沖溶液去調節(jié)其pH到中性時，變性了的質粒DNA又會恢復變性之前的構型而保存在溶液中，而染色體DNA則不能復性，形成纏連的網狀結構，經過離心，染色體DNA及其他大分子物質一起被去除。

方法：收集菌液，加入溶菌液，搖動混勻，冰浴10min。加入SDS-NaOH溶液冰浴10min。加入pH4.8的NaAC溶液冰浴10min。4℃10000r/min離心10min，小心地把上層清液倒入到另一個新離心管中，加入預冷好的無水乙醇，再把離心管放置-20℃冰箱中1h，沉淀析出DNA，離心10min，丟棄上清液，加入無菌水或TE緩沖液溶解DNA。

應用：堿裂解法主要用于菌液、動物毛發(fā)等樣品的DNA快速提取，其優(yōu)點在于簡單、快速，價格低廉，不需大型儀器設備。但是不足之處是十分明顯的：一是pH值調節(jié)不準確會導致隨后的PCR擴增經常失敗，二是提取的DNA中包含大量的蛋白質，純度不高，不適合做Southern或其他對DNA質量要求高的實驗。endprint

1.4 二氧化硅（硅粒）法

原理：當溶液中的pH值低于或等于二氧化硅表面pKa值時，二氧化硅表面攜帶的負電荷就會減少，與DNA分子帶的負電荷之間的排斥力也隨之減小，會形成很多的水合離子，降低了DNA分子的水合程度，DNA分子從而集聚到二氧化硅的表面上。另外，細胞裂解劑干擾了雙鏈DNA分子之間氫鍵的形成，從而產生了單鏈DNA分子，DNA單鏈分子與二氧化硅表面形成氫鍵，這種氫鍵力遠高于DNA分子與二氧化硅表面的靜電排斥力。先用洗滌液洗掉吸附有DNA分子的二氧化硅表面的其他雜質，再用pH值高于pKa的溶液洗脫吸附在二氧化硅表面上的DNA分子[13]。

方法：采用Rohland N[14]的方法步驟。

應用：二氧化硅法是基于常用于提取古DNA的硅粒法的基礎之上而改進的，傳統的硅粒法在提取DNA時僅僅使用了高濃度的異硫氰酸胍來裂解骨粉，這對骨粉只進行了有限的裂解，DNA并沒有完全的釋放出來[15]。本文采取的方法里的提取溶液含有EDTA和蛋白酶K，EDTA的作用是脫鈣，蛋白酶K的作用是消化組織和包圍了DNA的蛋白質，兩者結合使用，可以使骨粉得到更好的裂解，充分釋放出DNA。此方法簡單、經濟，可有效去除PCR抑制物，且提取的DNA純度高，適合實驗室常規(guī)、大規(guī)模使用，可提取年限久遠的骨骼DNA。

1.5 試劑盒法

原理：試劑盒法中含有吸附材料，可以特異性地吸附DNA，過濾RNA及蛋白質等雜質，市場上主要有硅離心試劑盒，磁珠法試劑盒等。

方法：每種試劑盒的操作步驟見各種試劑盒的說明書。

應用：試劑盒法操作簡單、規(guī)范，是提取和純化DNA的比較簡便的方法，硅離心柱試劑盒在市場上比較普遍，成本低，在提取古DNA研究中比較常用。磁珠法試劑盒提取純化DNA有著更好的效果，在提取古DNA實驗中有著明顯的優(yōu)勢，但是成本較高[16]。

2 DNA提取方法在古DNA研究中的應用案例

Faerman[17]等在提取古骨頭DNA鑒定性別時，使用了蛋白酶K消化，酚-仿抽提和Chelex純化相結合的方法，發(fā)現使用Chelex純化的DNA比不使用Chelex純化的DNA得到了更好的PCR結果，并且在該實驗中，Chelex的純化效果比其他方法好，可以適用于很少樣本量（少于1mg）的樣本。Tracqui和Ludes[18]在提取古人類骨頭DNA實驗中使用了酚-仿抽提法提取DNA，再用CleanMix purification kit純化DNA，所得的DNA在后續(xù)的PCR擴增等步驟中進行順利。Maria de Lourdes Mu?oz[19]等人利用3種方法提取前西班牙人（距今200～1500年）的骨頭及組織的DNA，并進行PCR擴增和測序，發(fā)現第1種方法最好。第1種方法：使用提取溶液（0.01M Tris-HCl，0.1 M EDTA and 0.2% SDS pH 8.0）和蛋白酶K消化及溫育后，再用酚-仿抽提法提取，接下來用Amicon? Ultra-0.5 30 kDa columns濃縮。第2種：使用提取溶液（0.01 M Tris-HCl， 0.5 M EDTA pH 8.0），溫育后再使用結合溶液（5M GuSCN， 0.025 M NaCl， 0.010 M Tris-HCl pH 8.0），然后QIAquick （Qiagen） silica column過濾，最后用TE緩沖液洗脫。第3種：苯酚-氯仿異戊醇（24∶4∶1）提取的DNA與5% Chelex-100在94℃煮10分鐘，再離心。郭麗萍[20]等在研究明代古尸時使用了經典的酚-仿抽提法和Chelex-100法提取肌肉DNA，并用QiAquick PCR Purification Kit （Qiagen）純化，得到了較好的結果。

Calvignac[21]等對古熊類樣本進行DNA提取時，先用蛋白酶K和提取溶液進行抽提，然后用苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）洗三次上清液，再用Centricon 30 column濃縮DNA并用超純水洗脫，最后用QIAquick kit （QIAGEN）純化。H?ss和P??bo[22]在提取25000年前的馬屬動物的DNA時使用了硅粒法，并將它鑒定為野驢。Rohland和Hofreiter[23]用更新世時期洞熊的骨頭和牙齒樣本試驗了Silica，Centricon，Phenol/chloroform，DNeasy tissue kit，DNeasy tissue kit，DNA IQ system這6種方法，發(fā)現silica方法效果最好，同時對silica方法進行了優(yōu)化。Dabney[24]等在研究更新世中期洞熊時用Rohland和Hofreiter的方法提取了35bp～150bp一系列的DNA片段，發(fā)現隨著DNA片段從150bp減少到35bp，提取效率也從75%降到25%。對此，他們改進了該方法，使之在提取35bp的DNA片段時達到提取150bp的效率。Cole[25]等報道了新西蘭古DNA的研究進展，包括幾維鳥、查塔姆島鴨和哈斯特鷹等生物，以及骨頭、毛發(fā)、博物館樣品中提取出的古DNA，成功揭露了新西蘭不同生物的進化史和系統進化樹。

Wood等[26]對新西蘭北部圖比多灣海岸線共濟會酒館考古遺址發(fā)現的距今750年左右的狗糞便化石分析時，一方面用EDTA、SDS和蛋白酶K溶液消化樣品，取上清液，再用Dneasy Blood & Tissue Kit （Qiagen， Valencia， CA， USA）提取DNA并進行PCR實驗分析，另一方面用氫氧化鉀和鹽酸對化石樣品預處理，再用顯微鏡對上浮液分析，結果表明了糞化石來自于歐洲人還未遷移到新西蘭之前的狗，并揭示了這些狗的飲食習慣。

蔡大偉等[27]使用了基于硅粒法和硅離心柱法的4種方法（方法A ：Modified Silica Particles Method；方法B：Ceneclean Method ；方法 C ：QIA amp Method；方法 D：Modified QIA quick method）提取5個距今約4000年的線粒體DNA，之后進行PCR擴增，發(fā)現基于硅離心柱方法的PCR成功率明顯優(yōu)于基于硅粒法的方法，Modified QIA quick method的效果最好。Levison等[28]用磁珠法從1.5mL的大腸桿菌JM109細胞培養(yǎng)中提取到了8.2?g的高質量的DNA，從每100?L的大馬哈魚精子水溶里提取到了至少14?L的DNA。樊龍江[29]對該方法稍作改進后，提取古稻樣品的DNA，并用植物界保守通用引物和水稻分子標記SSR引物對DNA進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠檢測，獲得了清晰的目標條帶。endprint

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