祁光宇， 劉 斌， 趙興緒

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度傳播性的豬特別是仔豬腸道疾病，以豬急性腸炎、水樣腹瀉、嘔吐和嚴(yán)重脫水為主要特征[1-2]。中國在2010年P(guān)EDV出現(xiàn)新的變異株[3]。這些新變異株造成較高的新生仔豬和哺乳豬發(fā)病率和死亡率[4]。PEDV感染不但給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，并且導(dǎo)致國內(nèi)豬肉價(jià)格上漲。

PEDV 基因組為單股正鏈 RNA，整個基因組長約為 28 Kb，編碼的必須結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有4種，分別為突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)[5-6]。PEDV的核心部分是N蛋白與基因組RNA結(jié)合形成的螺旋狀核蛋白體。N蛋白是PEDV已知結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是組成病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。除此之外，N蛋白還具有保守性強(qiáng)的特點(diǎn)，而豬在感染PEDV的早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生高水平的抗N蛋白抗體。因而利用N蛋白建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[7]。豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒病和細(xì)菌性腹瀉等從臨床癥狀上很難區(qū)分[8]，必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測才能確診。目前，檢測豬流行性腹瀉病毒的主要方法有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化等[9-10]，這些方法費(fèi)時費(fèi)力，所以快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對于豬流行性腹瀉的監(jiān)測和防控具有重要意義。本研究以原核表達(dá)的N蛋白為基礎(chǔ)制備單克隆抗體，以期為進(jìn)一步研制豬流行性腹瀉病快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑

豬流行性腹瀉病毒B2015株由中農(nóng)威特研發(fā)中心分離保存。載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。T-Vector pMDTM19 (Simple)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa Ex Taq?試劑盒、限制性內(nèi)切酶為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，One Step RT-PCR Kit、Gel Extraction Kit D2500瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑、Viral RNA Kit為OMEGA公司產(chǎn)品，克隆DH5α感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為全式金公司產(chǎn)品，His-trap HP型鎳離子親和層析柱為GE公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)國內(nèi)近幾年豬流行性腹瀉病毒株，參考GenBank中KX016034.1全基因組序列設(shè)計(jì)1對特異引物擴(kuò)增N基因。根據(jù)載體酶切位點(diǎn)的要求，引物分別加入BamH Ⅰ和XhoⅠ位點(diǎn)，引物NF序列為5′-AACGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCA-3′，，NR為5′-AGACTCGAGTTAATTTCCTGTATCGAAG-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 病毒總RNA提取與One Step RT-PCR擴(kuò)增

按照Viral RNA Kit試劑盒說明書提取豬流行性腹瀉病毒B2015株的基因組RNA。以提取的RNA為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增N基因。反應(yīng)體系: 5×Reaction buffer 10 μl，Template RNA 10 μl，Sense primer (10 μmol/L) 1 μl，Anti-sense primer (10 μmol/L) 1 μl，M-MLV RTase/TaqDNA Polymerase Mix 1 μl，Nuclease-free water 271 μl。反應(yīng)程序：42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將回收產(chǎn)物連接至T-Vector pMDTM19 (Simple)載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種至含100 μg/ml 氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定和測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pMDTM19-N和質(zhì)粒pET32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，對兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后，使用T4 DNA ligase分別連接同樣經(jīng)酶切后的質(zhì)粒pET32a(+)和質(zhì)粒pMDTM19-N，16 ℃連接過夜。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于Amp+LB固體培養(yǎng)基平板中，培養(yǎng)板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單菌落至Amp+LB液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定、測序。質(zhì)粒測序由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.5 重組N蛋白的表達(dá)、鑒定及純化

將測序正確的重組質(zhì)粒pET32a-N轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) Chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于Amp+LB平板中，挑取單菌落至Amp+LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化，加入終濃度為1 mmol/L IPTG在37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。將不同時間收集的菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀用50 μl PBS重懸后加等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水煮10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 表達(dá)蛋白純化及動物免疫

將大量表達(dá)的細(xì)菌沉淀用Binding Buffer重懸并用超聲波裂解菌體，離心取上清部分，參照His-trap HP型鎳離子親和層析柱說明書純化蛋白質(zhì)。將所得蛋白質(zhì)免疫6周齡BALB/c小鼠，同時做空白對照，在融合前3 d每只小鼠腹腔注射200 μg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.7 PEDV-N蛋白單抗的制備

小鼠尾靜脈取血，用ELISA方法測定各小鼠血清效價(jià)，效價(jià)高于1∶10 000的鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按聚乙二醇(PEG)方法進(jìn)行雜交融合。用間接ELISA對雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行篩選，陽性孔再經(jīng)過3次有限稀釋法進(jìn)行亞克隆[11]，待陽性率達(dá)到100%時擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻(xiàn)[12]制備腹水，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清液。

1.8 單克隆抗體Western blot檢測

將PEDV感染的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液和SDS處理，進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，轉(zhuǎn)PVDF膜后封閉。以制備的單克隆抗體反應(yīng)1 h, TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG反應(yīng)1 h, TBST洗滌后顯色進(jìn)行鑒定。同時設(shè)立空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白為陰性對照組。

1.9 單克隆抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測

用PEDV感染接種于24孔細(xì)胞板的Vero細(xì)胞。培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變時，先用甲醛固定細(xì)胞，PBS洗滌之后加入PBSA封閉1 h。PBS洗滌后加入制備的單克隆抗體反應(yīng)1 h，PBS洗滌干凈，并加入綠色熒光二抗反應(yīng)1 h，洗滌干凈后進(jìn)行熒光觀察。同時設(shè)未感染的細(xì)胞作空白對照。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV N基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的鑒定

對重組質(zhì)粒pET-32a-N進(jìn)行BamH I、XhoI雙酶切和PCR后進(jìn)行電泳，分別在約6 000 bp和1 326 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。測序結(jié)果顯示與標(biāo)準(zhǔn)基因同源性為100%，說明已成功構(gòu)建了豬流行性腹瀉病毒N基因原核表達(dá)載體pET-32a-N。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 8000；1：重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N對照；2：pET-32a-N的Bam H I、Xho I雙酶切；3：N基因的PCR產(chǎn)物。圖1 豬流行性腹瀉病毒N基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-32a-N of porcine epidemic diarrhea virus N gene

2.2 重組N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

含有重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示有1條分子量約為 6.8×104大小的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期大小一致，說明重組質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)(圖2)。將純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到NC膜上，用豬流行性腹瀉陽性血清進(jìn)行Western blotting鑒定。結(jié)果顯示，在分子量約 6.8×104處可見特異性條帶，而菌體蛋白無條帶(圖3)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)后的pET-32a(+)空載體；2：未誘導(dǎo)的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重組菌；3：誘導(dǎo)后的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重組菌。圖2 重組N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant N protein

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化N蛋白。圖3 純化的重組N蛋白Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis of purified recombinant N protein

2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選

用ELISA方法篩選得到穩(wěn)定的陽性雜交瘤細(xì)胞。將初步篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)3次亞克隆，共獲得2株穩(wěn)定分泌抗N蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C5D3和H3E7,將其擴(kuò)大培養(yǎng)后保存于液氮備用。

2.4 單克隆抗體C5D3和H3E7的Western blotting鑒定

2株單抗C5D3和H3E7均可特異性識別N蛋白，在分子量約 6.8×104處出現(xiàn)特異性條帶，而與空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白不發(fā)生反應(yīng)(圖4)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：C5D3株；2：H3E7株；3：陰性對照。圖4 單抗C5D3和H3E7株的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

2.5 單克隆抗體C5D3和H3E7的IFA分析

IFA檢測結(jié)果顯示，感染PEDV病毒的細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光，而對照組無熒光出現(xiàn)(圖5)，證明這2個單抗能特異地識別和結(jié)合PEDV病毒N蛋白。

3 討 論

中國近幾年P(guān)ED的發(fā)病率、死亡率均呈明顯上升趨勢，特別是從2010年10月以后，PED在中國廣泛流行并出現(xiàn)新的變異株。感染 PEDV后，哺乳仔豬死亡率可達(dá)80%～100%，但繁殖母豬和公豬感染后很少表現(xiàn)出臨床癥狀。PED大規(guī)模暴發(fā)的最主要原因是病毒的變異，這給PED的防控帶來了新的挑戰(zhàn)[13]。

在PEDV合成過程中，N蛋白既能與病毒RNA纏繞成為病毒粒子的核衣殼，又能結(jié)合磷脂和細(xì)胞膜，促進(jìn)形成RNA復(fù)合體，對病毒組裝有重要作用[5-6]。同時N蛋白的保守性很高，在豬感染早期，機(jī)體就可以產(chǎn)生抗N蛋白抗體，所以N蛋白可以作為早期診斷的靶蛋白，同時可以用于研制開發(fā)抗PEDV的表位疫苗[14]。

本試驗(yàn)通過構(gòu)建PEDVN基因重組質(zhì)粒pET-30a-N，然后以純化后的PEDV-N蛋白為免疫原免疫小鼠，成功制備了2株抗PEDV的單克隆抗體。經(jīng)ELISA和IFA方法檢驗(yàn)，制備的單抗均能與PEDV N蛋白和PEDV結(jié)合。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)對雜交瘤細(xì)胞系定期克隆化檢測抗體水平是很有必要的，其目的是防止雜交瘤細(xì)胞在長期傳代過程中喪失分泌抗體的功能，影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。對雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，2株單抗分泌能力穩(wěn)定性良好，未出現(xiàn)急性下降甚至消失的情況。在制備腹水過程中發(fā)現(xiàn)，C5D3株單抗細(xì)胞產(chǎn)生腹水量很少，H3E7株細(xì)胞產(chǎn)生的腹水量比較多。其中腹水量少的原因：一是于注射石蠟后7 d就注射細(xì)胞，時間過早；二是細(xì)胞量過多也會引起腹水過少或不出現(xiàn)，出現(xiàn)實(shí)體瘤現(xiàn)象[14]。

A：C5D3株；B：H3E7株；C：陰性對照。 圖5 單克隆抗體C5D3和H3E7與感染PEDV的Vero 細(xì)胞IFA 試驗(yàn)Fig.5 The indirect immunofluorescence assay (IFA) of PEDV in Vero cells with monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

快速、準(zhǔn)確以及操作簡單易行的診斷方法是有效防控疫病的基礎(chǔ)和前提條件。近年來在PED診斷方法上取得了很大進(jìn)展，目前已經(jīng)有很多新技術(shù)應(yīng)用于PED的診斷,比如ELISA、RT-PCR和免疫熒光技術(shù)[15]。雖然這些檢測方法準(zhǔn)確率較高，但所需試劑繁多、經(jīng)濟(jì)成本高，且有設(shè)備和技術(shù)要求，難以在基層推廣普及[16]。膠體金免疫層析法(GICA)是近些年發(fā)展起來的一種以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型免疫檢測技術(shù)，可以彌補(bǔ)儀器檢測方法的不足，在現(xiàn)場檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。本試驗(yàn)成功制備并鑒定了抗PEDV-N蛋白單克隆抗體，為豬流行性腹瀉病毒金標(biāo)試紙檢測方法的建立奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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