陳玉玲， 何夢(mèng)嬌， 許雄程， 伍曉紅， 李艷芬， 陳 超， 駱 凱

更年期婦女隨著體內(nèi)雌激素水平的下降，骨轉(zhuǎn)化增加，骨吸收程度超過骨形成，易出現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)，導(dǎo)致骨密度降低，骨組織出現(xiàn)吸收破壞[1]。隨著人們生活水平的提高，越來(lái)越多的成年人接受正畸治療，對(duì)成年患者尤其是更年期婦女在正畸治療過程中出現(xiàn)的牙槽骨缺損如骨開裂和骨開窗的處理是所有正畸和牙周醫(yī)生需要共同面對(duì)的問題。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet technology，CST)的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)PMO狀態(tài)下骨開裂和骨開窗的治療提供了一個(gè)可選擇的方法[2]。本研究擬通過體外培養(yǎng)PMO大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC)并構(gòu)建細(xì)胞膜片，從基因和蛋白水平檢測(cè)膜片中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的表達(dá)情況，為應(yīng)用CST實(shí)現(xiàn)PMO狀態(tài)下牙槽骨缺損的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(100±20) g[福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SYXK(閩)2012-0001]。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國(guó)Hyclone公司)；谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibico BRL公司)；維生素C、β-甘油磷酸鈉、茜素紅S、地塞米松、蘇木精、伊紅(美國(guó)Sigma公司)；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol?Reagent(美國(guó)Life Technologies公司)；兔抗大鼠纖維連接蛋白多克隆抗體(貨號(hào)ab2413,美國(guó)Abcam公司)；Alexa Fluor?488山羊抗兔 IgG(美國(guó)Jackson公司)；DAPI染色液、抗熒光淬滅封片劑(美國(guó)Amrsco公司)；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(中國(guó)Biosharp公司)；反轉(zhuǎn)錄及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(日本Takara公司)。

1.1.3儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heracell 150，德國(guó)Heraeus公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1B，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生物安全柜(7BZ-ZHF1200A2，上海力新儀器有限公司)；倒置熒光相差顯微鏡(IX-71，日本Olympus公司)；高速離心機(jī)(SABOFUGE400R，德國(guó)Heraeus公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 480，德國(guó)Roche公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(chemiscope5300，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；蛋白電泳-電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(PP-1150 POWERB-MINIP-4，北京凱元信瑞儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1PMO大鼠BMSC體外培養(yǎng) 參照課題組方法[3]，經(jīng)雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松大鼠模型。建模12周大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉處死，無(wú)菌條件下迅速取出完整股骨及脛骨，以DMEM培養(yǎng)液交替沖洗髓腔收集骨髓沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2PMO大鼠BMSC成骨分化能力檢測(cè) 將PMO大鼠BMSC以每孔1×105的密度接種于6孔板內(nèi)，用含2 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 mmol/L地塞米松和50 μg/mL維生素C的DMEM成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d后經(jīng)95%乙醇固定，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色。成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)14 d出現(xiàn)肉眼可見礦化結(jié)節(jié)時(shí)，棄培養(yǎng)液，茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)。

1.2.3PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片的構(gòu)建及觀察 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PMO大鼠BMSC，以每孔2×105密度接種于6孔板，加入含50 μg/mL維生素C的膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每隔3 d更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)10 d即可獲得細(xì)胞膜片。將細(xì)胞膜片固定后，梯度酒精脫水，浸蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, H-E)及Masson染色觀察膜片結(jié)構(gòu)。

1.2.4PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片F(xiàn)N基因表達(dá)檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PMO大鼠BMSC以每孔2×105密度接種于6孔板，用含50 μg/mL維生素C的膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，于培養(yǎng)5，10 d后棄培養(yǎng)液，根據(jù)試劑盒說明提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè)細(xì)胞膜片F(xiàn)N的表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：

GAPDH：

上游：CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG

下游：ACGACATACTCAGCACCAGCATCACC

FN：

上游：AGGAGAACCAGGAGAGCACA

下游：TCGGTCACTTCCACAAACTG

1.2.5PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片F(xiàn)N蛋白表達(dá)檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PMO大鼠BMSC，以每孔2×105密度接種于6孔板，以含50 μg/mL維生素C的膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d構(gòu)建細(xì)胞膜片。將細(xì)胞分成酶消化組和膜片組，酶消化組采用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，膜片組直接刮取細(xì)胞膜片。2組細(xì)胞加入裂解液后，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，配制適合濃度的 SDS-PAGE膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗GAPDH、FN 4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗孵育1～2 h?；瘜W(xué)發(fā)光顯色后采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.6PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片F(xiàn)N免疫熒光染色 石蠟包埋的PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片制備成4 μm切片，常規(guī)脫蠟，梯度酒精復(fù)水后，經(jīng)復(fù)合酶修復(fù)抗原后洗滌，滴加兔抗大鼠纖維連接蛋白，4 ℃孵育過夜，洗滌，滴加山羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，經(jīng)DAPI染色后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1PMO大鼠BMSC體外培養(yǎng)及成骨分化能力檢測(cè) 原代培養(yǎng)的PMO大鼠BMSC中紅細(xì)胞較多，經(jīng)多次換液后可見貼壁的梭形或紡錘形細(xì)胞，培養(yǎng)14 d即可達(dá)到近80%融合進(jìn)行傳代(圖1A)。經(jīng)成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)7 d，BMSC胞漿內(nèi)可見棕黑色顆粒狀集簇，ALP染色陽(yáng)性(圖1B)；成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)14 d，細(xì)胞局部聚集形成礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈橘紅色(圖1C)。

A：原代培養(yǎng)14 d； B：堿性磷酸酶染色； C：礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色.圖1 骨質(zhì)疏松大鼠BMSC原代培養(yǎng)及成骨分化能力檢測(cè)Fig 1 Primary culture and osteogenic differentiation potential of osteoporotic rat bone marrow stromal cell

2.2PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片觀察 PMO大鼠BMSC經(jīng)膜片誘導(dǎo)液培養(yǎng)10 d，即可在培養(yǎng)皿底部形成一薄膜樣結(jié)構(gòu)，邊緣皺褶卷曲，此時(shí)可用細(xì)胞刮刀或鑷子獲取細(xì)胞膜片(圖2A)。經(jīng)H-E及Masson染色，可見細(xì)胞膜片由多層細(xì)胞構(gòu)成，連接緊密，富含胞外基質(zhì)(圖2B,C)。

A：細(xì)胞膜片大體觀； B：細(xì)胞膜片H-E染色； C：細(xì)胞膜片Masson染色.圖2 骨質(zhì)疏松大鼠BMSC細(xì)胞膜片觀察Fig 2 Morphological observation of osteoporotic rat BMSC cell sheet

2.3PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片中FN基因及蛋白表達(dá)檢測(cè) 分別于膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)5,10 d后收集BMSC進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞膜片ECM中FN的mRNA表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果可見，BMSC細(xì)胞膜片組可見明顯的條帶影像(285 kD)，高表達(dá)FN；而酶消化組未見明顯條帶影像(圖3B)。經(jīng)Image J軟件分析發(fā)現(xiàn)，膜片組的FN蛋白表達(dá)水平顯著高于酶消化組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3C)。

2.4PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片中FN免疫熒光染色 免疫熒光染色結(jié)果可見PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片ECM中高表達(dá)FN，鏡下呈纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4)。

FN：纖維連接蛋白. A：細(xì)胞膜片F(xiàn)N基因表達(dá)qPCR檢測(cè)(培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)比較，△：P<0.05)； B：細(xì)胞膜片F(xiàn)N 蛋白表達(dá)Western-blot檢測(cè)(1：酶消化組；2：膜片組)； C：Western-blot檢測(cè)結(jié)果半定量分析(與酶消化組比較，△：P<0.05).圖3 骨質(zhì)疏松大鼠BMSC細(xì)胞膜片F(xiàn)N基因及蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig 3 Gene and protein detection of FN in osteoporotic rat BMSC cell sheet

FN：纖維連接蛋白；DAPI:4′，6-二脒基-2-苯基吲哚； Merge:疊加.圖4 骨質(zhì)疏松大鼠BMSC細(xì)胞膜片免疫熒光染色Fig 4 Immunofluorescent staining of FN in osteoporotic rat BMSC cell sheet

3 討 論

1995年，日本學(xué)者Okano等報(bào)道采用CST技術(shù)將培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合后即可形成膜片樣組織，應(yīng)用于組織的再生修復(fù)[2]。當(dāng)前CST已廣泛應(yīng)用于組織再生的各個(gè)領(lǐng)域，如心肌組織、角膜和皮膚等[4-5]。利用不同來(lái)源的細(xì)胞，作為種子細(xì)胞采用CST可實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生[6-10]。上述研究提示，利用CST有望實(shí)現(xiàn)正畸治療中出現(xiàn)的牙槽骨“骨開窗”和“骨開裂”。

BMSC是組織工程技術(shù)理想的種子細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，易于體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生[11]。報(bào)道顯示，BMSC體外連續(xù)培養(yǎng)可獲得富含ECM的細(xì)胞膜片，與β-磷酸三鈣復(fù)合后植入裸鼠皮下可形成骨樣組織[12-13]，植入犬牙周骨缺損中可實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生[8]。由頜骨BMSC膜片與牙周膜干細(xì)胞膜片聯(lián)合構(gòu)建的復(fù)合膜片高表達(dá)成骨及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因與蛋白，復(fù)合膜片與富血小板纖維蛋白聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)可形成生理性牙周組織結(jié)構(gòu)[14-15]。將BMSC膜片與牙周膜干細(xì)胞膜片聯(lián)合應(yīng)用可充分利用兩種細(xì)胞的特點(diǎn)修復(fù)犬牙周組織缺損[9]。當(dāng)前有關(guān)BMSC膜片的研究主要以健康狀態(tài)的BMSC為種子細(xì)胞，本研究在體外培養(yǎng)PMO大鼠BMSC的基礎(chǔ)上構(gòu)建細(xì)胞膜片并檢測(cè)膜片中ECM的表達(dá)情況。

以往研究多采用溫度反應(yīng)培養(yǎng)皿來(lái)構(gòu)建膜片。采用該方法需要特殊的設(shè)備，同時(shí)所構(gòu)建的膜片由單層細(xì)胞構(gòu)成，膜片較薄，不利于操作。本研究參照文獻(xiàn)[16]，采用維生素C連續(xù)培養(yǎng)法構(gòu)建PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片。采用該方法無(wú)需特殊培養(yǎng)設(shè)備，僅通過在培養(yǎng)液中添加維生素C進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，使細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，最終形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的完整的細(xì)胞膜片。維生素C又名抗壞血酸，為水溶性維生素，可刺激細(xì)胞增殖并分泌大量ECM，加速細(xì)胞膜片的形成[17]。本研究qPCR結(jié)果顯示，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PMO大鼠BMSC在基因水平表達(dá)更多的FN，提示研究所用維生素C在BMSC細(xì)胞膜片構(gòu)建中發(fā)揮重要的作用，促進(jìn)細(xì)胞形成豐富的ECM。傳統(tǒng)組織工程技術(shù)需將細(xì)胞消化后接種于支架材料，該過程不可避免的會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞ECM的流失，破壞細(xì)胞表面受體及信號(hào)分子等，在一定程度上影響細(xì)胞的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，采用維生素C連續(xù)培養(yǎng)法構(gòu)建的細(xì)胞膜片與酶消化后的BMSC相比，膜片中FN蛋白的含量更高，該結(jié)果提示采用CST構(gòu)建的細(xì)胞膜片可避免酶消化對(duì)細(xì)胞的影響，保留更多的ECM，為實(shí)現(xiàn)組織再生創(chuàng)造有利的條件。

ECM是由多種蛋白和多聚糖構(gòu)成的精細(xì)復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其基本成分包括I型膠原、FN及層黏連蛋白等，還包括一些特殊蛋白如生長(zhǎng)因子和蛋白多糖等[18-19]。ECM可為細(xì)胞和組織提供全面的支持，在維持細(xì)胞的基本生命活動(dòng)方面發(fā)揮重要的作用[18]。FN是由兩個(gè)多肽糖蛋白亞基經(jīng)由二硫鍵連接形成的大分子糖蛋白，包括血漿型FN和細(xì)胞型FN兩種類型。細(xì)胞型FN可表達(dá)于細(xì)胞和ECM中，是ECM中蛋白質(zhì)相互整合的關(guān)鍵因素。FN所形成不可溶性纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞粘附、遷移及ECM蛋白沉積方面發(fā)揮重要作用[20]。本研究采用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的PMO大鼠BMSC膜片中富含F(xiàn)N，說明所構(gòu)建的膜片具有一定的生物學(xué)功能，自身分泌的ECM有望為膜片自體移植實(shí)現(xiàn)組織再生尤其是牙槽骨缺損的修復(fù)提供幫助。

盡管在本研究條件下采用維生素C培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)可成功獲取富含ECM的PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片，但課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，PMO狀態(tài)下BMSC的成骨分化能力減弱[11]。因此，所構(gòu)建的細(xì)胞膜片的成骨分化能力如何，其在體內(nèi)能否修復(fù)正畸治療所致的牙槽骨缺損尚有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探討。