王靜 黃忠 魏尉 候聰 王霆宇 羅紅發(fā)(自貢市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 自貢 643000)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP) 死亡率高， 近年來有研究提示作為始發(fā)因子的腫瘤壞死因子(TNF-α)通過級聯(lián)反應形成瀑布效應導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生[1]，而高遷移率族蛋白-1(HMGB1 )[2]作為晚期炎性介質，或許通過某些傳導通路加重SAP，烏司他丁(ulinastatin)則可減少SIRS及MODS的發(fā)生并改善預后。其中急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)/急性肺損傷(Acute Lunginjury,ALI)為其最嚴重且最常見的并發(fā)癥之一，能給予早期防治對降低其病死率意義重大。本研究試圖通過SAP大鼠模型及采用烏司他丁干預，探討HMGB1、TNF-α、白介素1β(IL-1β)在SAP大鼠胰腺炎肺損傷中的機理及烏司他丁的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 健康SD大鼠54只(雄性，清潔級，體質量200～250g)；?；悄懰徕c；烏司他??；大鼠 HMGB1、TNF-α、IL-1β的ELISA試劑盒；大鼠HMGB1多克隆抗體。

1.2 動物分組及造模 SD大鼠54只，完全隨機分為SAP組、治療組及對照組三組，每組各18只，每組再各分為6、12和24h亞組(n=6)。①對照組：開腹后僅撥動胰腺組織。②SAP組：參照Zhang等[3]方法用制作SAP模型。③治療組：于SAP大鼠尾靜脈注射烏司他丁予以治療。

1.3 各指標的測定及方法 于6、12和24h分別處死各組大鼠，提取血清及胰腺、肺組織，血清用于ELISA檢測；胰腺及肺組織用于病理學檢測，其中胰腺組織行免疫組化檢測及ELISA檢測。

1.4 胰腺及肺病理觀察 胰腺按Schimidt法[4]評分 將肺按Frank法[5]評分 ，EPS-G7法檢測動脈血氣分析；ELISA法檢測血清、肺、胰中的HMGB1蛋白濃度；ELISA法檢測血清中的TNF-α、IL-1β蛋白濃度；免疫法檢測胰腺組織中的HMGB1，免疫組化結果判定[6]：結果判定在放大400倍的條件下。細胞膜或胞漿內(nèi)棕黃色顆粒為(+)，選擇10個高倍視野，據(jù)HMGB1陽性細胞與總細胞數(shù)比值定為0～4分：陽性細胞數(shù)<5%記0分，陽性細胞數(shù)5%．25%記1分，陽性細胞數(shù)26%．50%記2分，陽性細胞數(shù)5l%．75%記3分，陽性細胞數(shù)>75%記4分。

2 結果

2.1 3組大鼠胰腺組織病理改變 ①胰腺組織：對照組大鼠胰腺鏡下無明顯變化；鏡下可見SAP組胰腺小葉間水腫、破壞、出血、炎性細胞浸潤、壞死。SAP組、治療組評分明顯高于對照組且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。② 肺組織：對照組大鼠胰腺及鏡下無明顯變化；SAP組大體可見，肺表面呈暗紅色，可伴胸腔少量積液；SAP組可見肺間隔增寬，肺組織水腫、出血、肺泡腔融合、大量炎性細胞積聚甚至肺實變，SAP組及治療組肺病理改變隨時間延長而加重，嚴重程度：24>12>6h，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各組大鼠肺病理評分，見表1。③ 胰腺組織HMGB1表達見圖2。

圖1 3組大鼠胰腺組織病理HE染色(×400)Figure 1 Histopathological changes of pancreas in three groups observed by HE staining (× 400)

圖2 3組大鼠胰腺組織中的HMGB1表達(EnVision兩步免疫組織化學法×400)Figure 2 HMGB1 expression in pancreatic tissue of three groups (× 400)

2.2 血氧分壓測定 SAP組、治療組血氧分壓數(shù)值明顯低于對照組且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組數(shù)值明顯高于SAP組且低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

Table1Comparisonofthepathologicalscoresofthepancreasandlungtissueandthechangeofbloodoxygenpartialpressure

組別術后時間(h)胰腺組織肺組織血氧分壓(mmHg)對照組61．21±0．222．33±0．1989．33±3．99121．33±0．212．47±0．2288．47±4．29241．39±0．252．66±0．2587．64±4．75SAP組68．11±0．70①3．88±0．30①78．64±7．31①1210．60±0．69①4．82±0．41①72．45±8．67①2412．12±0．73①5．75±0．39①67．34±7．6①治療組65．37±0．18①②2．91±0．33①②85．71±7．12①②127．77±0．36①②3．46±0．19①②80．42±6．73①②249．88±0．56①②4．65±0．23①②74．92±7．55①②

注：與對照組同期比較，①P<0.05；與SAP組同期比較，②P<0.05

2.3 ELISA法檢測血清、胰腺及肺中的HMGB1蛋白濃度 各濃度在6～24h持續(xù)上升，與對照組比較升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組與 SAP組比較降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β蛋白濃度 SAP組、治療組的血清中的TNF-α、IL-1β蛋白濃度在6h 至2h繼續(xù)升高，于24h下降，與對照組比較升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組與 SAP組比較降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3

Table2HMGB1proteinconcentrationinserum,pancreasandlungtissue

組別術后時間(h)血清中的HMGB1(ng/ml)胰腺中的HMGB1(ng/ml)肺中的HMGB1(ng/ml)對照組698±15．6150±13．7112±14．112103±16．2155±14．9123±17．524110±13．4177±15．5136±20．3SAP組6223±11．5①233±17．1①192±27．7①12287±20．9①337±18．7①273±23．3①24362±19．3①375±22．5①308±24．9①治療組6223±15．8①②205±20．8①②172±19．5①②12241±17．5①②280±16．3①②221±23．4①②24279±21．6①②304±23．5①②259±18．3①②

注：與對照組同期比較,①P<0.05； 與SAP組同期比較，②P<0.05

表3 各組大鼠血TNF-α、IL-1β水平比較Table 3 The blood TNF-α and IL-1β in each group

注：與對照組同期比較,①P<0.05； 與SAP組同期比較，②P<0.05

2.5 胰腺中HMGB1表達(免疫組化) 在對照組少量腺泡細胞胞漿表達，SAP組胰腺腺泡胸次漿及胞核可見HMGB1強表達：SAP組>治療組>對照組，從6～24h持續(xù)上升，見表4。

Table4ThepancreaticHMGB1positivecellsscorewithimmunocytochemistry

組別術后6h術后12h術后24h對照組0．111±0．0190．141±0．0210．152±0．019SAP組2．711±0．316①3．61±0．471①3．832±0．419①治療組2．132±0．345①②2．762±0．545①②3．007±0．423①②

注：與對照組同期比較,①P<0.05； 與SAP組同期比較，②P<0.05

3 討論

HMGB1為非組DNA結合蛋白，可通過多途徑促使炎癥反應增強，致炎癥失控遷延[7]。Mouri[8]等從基因水平揭露HMGB1與其他炎性介質相互加強的分泌效應及其相關的分泌調節(jié)網(wǎng)絡。細胞受損壞死時, 核內(nèi)HMGB1釋放到細胞外激活免疫及炎性反應，致單核等細胞分泌炎性因子。而炎性因子刺激HMGB1分泌成為正反饋環(huán)路, 再加重炎癥反應[9]。

SAP病死率高，1周內(nèi)病死者多為ARDS/ ALI所致。因此，在SAP早期降低肺損傷具有十分重要的意義。TNF-α和 IL-1β為SAP早期促炎因子，在肺損傷中TNF-α和IL-6主要作用是使聚集中性粒細胞并激活釋放氧自由基且損傷其內(nèi)皮細胞[10]。c-Jun氨基端激酶(JNK)為SAP加重的關鍵介質之一，各類炎癥因子可激活JNK信號通路，而該通路激活又可反過來進一步加重炎癥反應[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]炎癥因子如TNF-a、IL-1等引起的JNK信號通路激活可通過上調激活蛋白-1(AP-1)的轉錄活性，促進肺損傷發(fā)生。有研究[13]證實JNK信號通路在SAP相關肺損傷中起關鍵作用，TNF-a可誘導單核因子如IL-1β、IL-6合成，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應[14]。

本實驗表明SAP胰腺損傷與HMGB的異常表達有關。同時，HMGB1表達上升比TNF-α和 IL-1β晚：胰腺中和血清及胰腺組織中的HMGB1數(shù)據(jù)顯示，從6～24 h持續(xù)上升，進一步證明HMGB1為晚期炎性介質。Yuan[15]等研究顯示，HMGB1可能以關鍵性的晚期炎癥因子參加了SAP的炎癥反應及各器官損害。也有學者證實HMGB1可進一步加重體液外滲，形成胰源性腹水[16]，楊智勇等[17]則發(fā)現(xiàn)SAP組大鼠血清TNF-α和 IL-1β水平在建模后迅速升高，在6～12 h持續(xù)上升，24小時開始下降，本研究也進一步證明TNF-α和 IL-1β為早期炎性介質。

烏司他丁對胰蛋白酶等多種酶有抑制作用，還能抑制溶酶體酶的釋放，清除氧自由基，阻斷中性細胞聚集，抑制炎癥因子及介質的釋放[18]，減輕SAP中SIRS反應并預防肺損傷的發(fā)生。楊野等[19]實驗顯示作為晚期炎性介質的HMGB-1可能參與了SAP肝損傷的過程；李梁等[20]運用meta分析顯示，烏司他丁治療SAP的療效勝于常規(guī)治療,其效果主要出現(xiàn)在病程中晚期。本實驗進一步證實烏司他丁能有效治療SAP。

4 結論與啟示

SAP大鼠胰腺中的致炎作用可能是由早期炎癥因子TNF-α、 IL-1β等激活JNK信號通路，且促炎因子促使HMGB1分泌形成正反饋環(huán)路,HMGB1可通過級聯(lián)反應形成瀑布效應，最終使炎癥失控遷延。而烏司他丁可能是通過降低SAP大鼠胰腺組織中的HMGB1、TNF-α、 IL-1β的表達及中斷JNK信號通路而發(fā)揮保護作用。因此，通過降低HMGB1及TNF-α、 IL-1β的表達及中斷JNK信號通路為治療靶點，可望用于治療SAP。

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