高潔 嚴(yán)敏 付婷 邵中軍

丙型肝炎是臨床工作中比較常見(jiàn)的一類(lèi)傳染病，該病主要是由丙型肝炎病毒感染通過(guò)人體的免疫途徑引起正常肝臟細(xì)胞的破壞導(dǎo)致的[1]。丙肝可以通過(guò)血液以及體液等多種方式在人群中間傳播，臨床癥狀有發(fā)熱、惡心、嘔吐等。該病如果不及時(shí)治療，易進(jìn)展為肝硬化甚至導(dǎo)致患者罹患肝癌[2]，因此，如何對(duì)丙肝進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確的診斷成為臨床研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)與研究，目前主要通過(guò)檢測(cè)致病病毒（HCV）RNA的含量進(jìn)行丙肝的特異性檢測(cè)。該方法科學(xué)準(zhǔn)確，能夠很好的診斷丙型肝炎。提取病毒的RNA有多重方式可以選擇，出于經(jīng)濟(jì)以及可行性等多方面的綜合考慮，臨床主要采取氯仿—異丙醇法以及核酸分離柱兩種方法對(duì)丙型肝炎病毒的RNA進(jìn)行提取[3]。為了研究?jī)煞N提取方法臨床價(jià)值的差異，為臨床工作提供選擇依據(jù)，本研究利用治療的110例患者的樣本采用熒光定量PCR的方法對(duì)兩種提取RNA的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在2016年9月—2017年9月乙肝防治示范區(qū)醫(yī)院門(mén)診診斷的患有丙型肝炎患者的血清樣本110份進(jìn)行觀察研究。所有提供血清的患者年齡19～63歲，平均年齡（32.12±2.10）歲，按照隨機(jī)化的原則把這些血清樣本分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，保證兩組樣本數(shù)相同。其中實(shí)驗(yàn)組樣本數(shù)55份，樣本提供者女性有20例，男性35例，提供者年齡26～68歲，平均年齡（44.42±3.18）歲；對(duì)照組樣本數(shù)55份，樣本提供者女性有23例，男性32例，提供者年齡27～67歲，平均年齡（45.33±2.97）歲，兩組樣本間對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，可比較。

1.2 儀器與試劑

本次研究使用的熒光定量PCR儀器使用的是美國(guó)AB公司的ABI 7500 FAST分析儀。兩種不用的提取方法使用的試劑（提取劑、擴(kuò)增劑）全都購(gòu)買(mǎi)于天根生化科技(北京)有限公司，生化試劑采購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)公司。

1.3 RNA的提取方法

（1）實(shí)驗(yàn)組血清樣本采用核酸分離柱的方法進(jìn)行RNA的提取。①離心管內(nèi)放入RNA酶的抑制劑，防止RNA被分解[4]。抑制劑的用量選擇20 μl，在同一離心管內(nèi)加入血清標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)放入用于幫助RNA凝結(jié)沉淀的裂解液，該溶劑用量為100 μl，輕柔地把以上溶劑混勻[5]，然后進(jìn)行加熱處理，時(shí)間為10分鐘，加熱溫度選擇70℃，對(duì)加熱過(guò)的溶劑離心，時(shí)間5～6秒。將無(wú)水乙醇放入離心管內(nèi)，同樣輕柔地?fù)u晃混勻，乙醇用量為110 μl；②以上操作完成后，把離心管內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移入提取柱中，使用裝置的負(fù)壓功能將液體和沉淀分開(kāi)，去除液體。然后使用A和B洗滌液對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，洗滌液用量采用500 μl；③操作完成后把提取柱取出，放入離心管中，轉(zhuǎn)速選擇14 000轉(zhuǎn)，離心1分鐘。離心完成后再次將其置入新的離心管，向其中加入洗脫液，量為50 μl，加樣的時(shí)候注意應(yīng)置于膜的中央位置，安靜放置1分鐘后，用10 000轉(zhuǎn)的速度進(jìn)行離心，再次加入洗脫液12.5 μl，接著按照熒光定量PCR的操作步驟進(jìn)行RNA的檢測(cè)，分析本方法提取RNA的效率以及重復(fù)性。（2）對(duì)照組樣本選擇氯仿-異丙醇的方法對(duì)RNA進(jìn)行提取。①離心管內(nèi)放入裂解液，該溶劑用量為100 μl，在同一離心管內(nèi)加入血清標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品，輕柔地用滅過(guò)菌的吸頭把以上溶劑混勻，向其中加入氯仿50 μl，混勻離心。②在另一個(gè)干凈的離心管中加入異丙醇，加入上一步離心產(chǎn)生的上清液，混勻后用13 000 r/min的速度進(jìn)行離心，時(shí)間為15分鐘。棄上清后再次離心，加入DEPC后選擇2 000轉(zhuǎn)的速度離心5分鐘，之后采用PCR進(jìn)行提取結(jié)果的檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)

檢測(cè)兩種提取方法提取RNA的效率以及重復(fù)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用（x-±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間樣本提取效率的比較

用PCR方法檢測(cè)兩組提取RNA的效率（HCV RNA濃度高于1.0×103copies/ml可以檢測(cè)到RNA），兩組樣本比較，實(shí)驗(yàn)組樣本提取效率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見(jiàn)表1。

表1 提取效率的比較[n（%）]

2.2 組間樣本重復(fù)性的比較

取同一份樣本用兩種不同的方法連續(xù)提取10次RNA，計(jì)算RNA含量的對(duì)數(shù)值以及10次提取的變異系數(shù)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組患者為7.82，變異系數(shù)為16.93%；對(duì)照組患者RNA定量為6.79，變異系數(shù)為38.64%。實(shí)驗(yàn)組患者的變異系數(shù)小于對(duì)照組，重復(fù)性高。

3 討論

丙型肝炎危害大，并發(fā)癥嚴(yán)重，如果不及時(shí)診斷易形成肝硬化，威脅患者的生命健康安全，因此，該病受到臨床的較大重視。研究證明，檢測(cè)丙型肝炎的RNA是一種高效的特異性檢測(cè)方法，可做出明確的診斷[6-7]。檢測(cè)RNA大多采用臨床最新提出的PCR方法，該方法科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，操作過(guò)程不易受到其他因素的干擾或者污染，可以精確地檢測(cè)出送檢血清中是否含有丙型肝炎病毒的RNA并測(cè)量出其具體數(shù)值；而且PCR檢測(cè)結(jié)果測(cè)定較迅速，節(jié)約時(shí)間，過(guò)程也比較簡(jiǎn)便，易于在臨床推廣和普及[8]。

本研究使用的熒光定量PCR的檢測(cè)技術(shù)采用事先提取出的病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，可以對(duì)其RNA做出精確的檢測(cè)，已經(jīng)成為臨床的常用檢測(cè)手段。在進(jìn)行PCR檢測(cè)前，首先需要提取出病毒的一部分RNA作為檢測(cè)擴(kuò)增的模板，而病毒RNA的提取方式有多種，本次研究選取了最常用的兩種，即核酸提取柱的方法以及氯仿—異丙醇提取方式。相關(guān)資料顯示，前一種方式的提取效率以及重復(fù)性更高。筆者分析認(rèn)為，核酸提取柱的方法有這些優(yōu)點(diǎn)主要與以下原因有關(guān)：（1）該方法在提取過(guò)程中需要加入RNA酶的抑制劑，可以有效地降低RNA分解酶的活性，減少RNA的降解，提高了RNA在標(biāo)本血清中的濃度。（2）氯仿—異丙醇提取方法操作更加繁瑣，操作步驟較提取柱的方式更多，需要多次離心與更換離心管，在多次的震蕩離心過(guò)程中，極易造成RNA的丟失與降解，使最終的提取濃度過(guò)低而無(wú)法檢測(cè)。（3）提取柱提取方法加入的裂解液中含有幫助RNA凝聚沉淀的助沉劑，可以促進(jìn)RNA凝聚成固態(tài)物質(zhì)并吸附在提取柱中的吸附膜上，有利于減少RNA的丟失，增加提取RNA的量。本次研究中，采用核酸提取柱的方式提取RNA的實(shí)驗(yàn)組血清標(biāo)本，RNA的提取效率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；實(shí)驗(yàn)組患者也具有更高的重復(fù)性，P＜0.05。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果佐證了以上的分析。

綜上所述，使用熒光定量PCR的方法可以比較好的比較氯仿—異丙醇以及核酸提取柱對(duì)HCV RNA提取的效果差異，核酸提取柱的方式提取RNA效率更高，重復(fù)性更好。

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