曾娟妮 楊 敏 劉 筱 李文華 周雯婷

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410005

慢性難愈合創(chuàng)面因虛感邪，邪氣致瘀，經(jīng)久不愈，損其正氣，正虛邪盛，不能托毒外出，瘀阻傷正，正損致腐，最終形成虛、邪、瘀、腐相互作用、互為因果的變化，其中虛是受邪的條件及血瘀傷正的結(jié)果。中醫(yī)學(xué)對難愈合創(chuàng)面的認(rèn)識(shí)有著悠久的歷史，數(shù)千年來，歷代醫(yī)家不斷總結(jié)治療經(jīng)驗(yàn)，積累了煨膿長肉、祛腐生肌、活血化瘀等豐富的治療方法，但是由于中藥復(fù)方藥物成分復(fù)雜，具有多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)，給研究帶來一定難度，其促愈機(jī)制目前探索不明。中醫(yī)藥治療慢性難愈合創(chuàng)面因其療效佳、費(fèi)用低等特點(diǎn)，深受廣大醫(yī)生及患者歡迎。美洲大蠊提取液，具有通利血脈、散瘀活血、養(yǎng)陰生肌的作用，包含著中醫(yī)扶正驅(qū)邪相輔相成的治療法則，被廣泛應(yīng)用在創(chuàng)面修復(fù)、胃潰瘍、腫瘤等領(lǐng)域[1-2]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于難愈合創(chuàng)面，取得滿意療效[3-4]，同時(shí)采用PCR、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液在肉芽生長期上調(diào)VEGF及TGF表達(dá)加速創(chuàng)面愈合，但促愈機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用日立 H7700透射電鏡(10000倍),觀察難愈合創(chuàng)面愈合過程中不同時(shí)間點(diǎn)傷口基底細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(微絲、橋粒)，進(jìn)一步驗(yàn)證美洲大蠊提取液促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)的作用優(yōu)勢,為臨床推廣應(yīng)用美洲大蠊提取液防治慢性難愈合創(chuàng)面提供一種可靠的治療方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年SPF 級 Wistar 雄性大鼠40只(NO.43004700026384)，12 周齡，體重 220g～250g，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周。

1.1.2 藥材 美洲大蠊提取液組所敷紗條用美洲大蠊提取液(康復(fù)新，國藥準(zhǔn)字Z43020995，湖南中南科倫藥業(yè)有限公司)。貝復(fù)濟(jì)組所敷紗條用貝復(fù)濟(jì)(國藥準(zhǔn)字S10980075，珠海億勝生物制藥有限公司)。

1.2 方法1.2.1 造模 參照付小兵等[5]全層皮膚缺損法經(jīng)改進(jìn)制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。將40只大鼠隨機(jī)分為：空白組(急性全層皮膚缺損組)10只、對照組(慢性難愈合創(chuàng)面組) 30只?？瞻捉M大鼠根據(jù)模型建立方法在造模區(qū)行全層皮膚切除，但不注射氫化可的松；慢性難愈合創(chuàng)面組大鼠在造模區(qū)行全層皮膚切除后立即注射氫化可的松，制備慢性難愈合創(chuàng)面模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組10只、美洲大蠊提取液組10只和貝復(fù)濟(jì)組10只，各組創(chuàng)面制備后即開始藥物干預(yù)，并每天換藥1次。

1.2.2 給藥 ①美洲大蠊提取液組：創(chuàng)面外敷兩層美洲大蠊提取液紗條(0.2 mL/cm2)，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，再加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。②貝復(fù)濟(jì)組：創(chuàng)面外敷兩層貝復(fù)濟(jì)浸透紗布(60U/cm2)，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，再加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。③模型組：創(chuàng)面外敷兩層生理鹽水紗布，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。④空白組：備皮處外敷兩層生理鹽水紗布，按備皮面積大小剪成小塊貼于備皮處，加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定，不作其他干預(yù)。

1.2.3 取材 模型制備完成后，各組于 7 d、15 d共 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)在4組分別隨機(jī)取 4只大鼠用 20%烏拉坦 5 mL/kg 腹腔注射麻醉后，取造模區(qū)創(chuàng)面組織，空白組取備皮處的相應(yīng)部位全層皮膚，深達(dá)筋膜層。所取組織樣品在 4℃ PBS 清洗，投入 2.5%電鏡級戊二醛固定液，備透射電鏡觀察。 1.2.4 電鏡觀察 ①取材：組織塊約 1×1×3 mm3。②制片：首先2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定 2 h以上。用 0.1M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次 10～15 min，1%鋨酸固定液固定 1～2 h。用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次10～15 min。再脫水：50 %丙酮10～15 min ；70%丙酮 10～15 min；90 %丙酮 10～15 min；100%丙酮 15～20 min，中間更換一次。再浸泡、包埋：純丙酮+包埋液(1∶1)37℃ 12 h；純包埋液 37 ℃ 10～12 h。最后固化：37度烘箱內(nèi)過夜，60 ℃烘箱內(nèi)12～24 h。 超薄切片機(jī)切片 50～100 nm。③3 %醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色。④日立 H7700透射電鏡觀察、拍片。圖像采集均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院電鏡室代為完成。觀察各組傷口愈合處基底細(xì)胞的顯微形態(tài)。

1.2.5 橋粒定量分析 角質(zhì)形成細(xì)胞之間借助橋粒互相連接，電鏡下可見中央層和附著斑，其上有張力微絲附著，橋粒的主要作用是維持細(xì)胞間的連接，能阻止溶液中的分子，特別是大分子沿著細(xì)胞間的縫隙滲入體內(nèi)，維持細(xì)胞一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。美洲大蠊提取物組在難愈合創(chuàng)面上促進(jìn)傷口愈合優(yōu)勢，研究組特意選取創(chuàng)面細(xì)胞中的橋粒作為觀察指標(biāo)。創(chuàng)面肉芽組織選取第3、7、15天時(shí)4組標(biāo)本各6例。橋粒定量采取10000倍下透射電鏡下觀察計(jì)算橋粒面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微絲、橋粒等超微結(jié)構(gòu) 4組標(biāo)本微絲、橋粒等超微結(jié)構(gòu)，美州大蠊提取液組顯示最佳，貝復(fù)濟(jì)組次之，空白組更次，模型組最少。如圖1、圖2所示。

2.2 橋粒面積 應(yīng)用透射電子顯微鏡，對24例標(biāo)本橋粒面積統(tǒng)計(jì)，換藥第3、7、15天時(shí)，美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組與空白組橋粒表達(dá)水平均明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 透射顯微鏡觀察比較各組不同時(shí)期的橋粒面積表達(dá)水平 (nm,10000x)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

3.1 微絲、橋粒結(jié)構(gòu)形態(tài)比較 美洲大蠊提取液組與其他組別比較，微絲密集，緊致，與空白組及模型組有差異；美洲大蠊提取液組創(chuàng)面新生細(xì)胞之間存在電子密度稍高的橋粒，與模型組及空白組比較有差異。表明美洲大蠊提取液加速創(chuàng)面新生細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形成，從而維持一個(gè)正常穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。

3.2 橋粒結(jié)構(gòu)量化分析 正常新生細(xì)胞之間橋粒連接約20～25 nm，治療第15天時(shí)，美洲大蠊提取液作用下的創(chuàng)面細(xì)胞間的橋粒面積為(25.7±1.53) nm，連接結(jié)構(gòu)近乎正常細(xì)胞間面積，貝復(fù)濟(jì)組橋粒面積為(23.3±2.06) nm，兩者差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與其他各組間差異性大，且隨著創(chuàng)面愈合時(shí)間越長，美洲大蠊提取液組與模型組及空白組之間差異越來越大，進(jìn)一步表明橋粒的形成成功阻止溶液中大分子沿著細(xì)胞間的縫隙滲入體內(nèi)，維持細(xì)胞一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境從而加速創(chuàng)面愈合。

創(chuàng)面的愈合涉及炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮角質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的遷移、增殖和分化，細(xì)胞生長因子分泌，基質(zhì)沉積等[6-7]，難愈合創(chuàng)面細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)是潛在的創(chuàng)面愈合生長標(biāo)志物，微絲(microfilament)是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與細(xì)胞分裂時(shí)收縮環(huán)形成，橋粒(bridge granule)多見于上皮，尤以復(fù)層扁平上皮細(xì)胞間較多，橋粒上有張力微絲附著，張力微絲是角蛋白的前身，它對保持細(xì)胞形態(tài)起重要作用，故橋粒對新生細(xì)胞的形態(tài)維持起重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示美洲大蠊提取物對難愈合創(chuàng)面新生細(xì)胞的形成有著絕對優(yōu)勢，也進(jìn)一步證明美洲大蠊提取物通過增加微絲及橋粒的數(shù)量加速細(xì)胞分裂，加速肌肉收縮,使微絨毛,應(yīng)變纖維，胞質(zhì)環(huán)流以及加速細(xì)胞間連接，阻止溶液中大分子沿著細(xì)胞間的縫隙滲入體內(nèi)，維持細(xì)胞一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境從而加速創(chuàng)面愈合。

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