湯祝華 梁曉涵 王海靈 王丹 黨政

摘要 采用QuEChERS前處理方法聯(lián)合超高效液相色譜一串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）檢測，建立了蘋果中滅菌丹殘留量的檢測方法。依據(jù)滅菌丹的化學性質特點優(yōu)化了流動相組成和質譜條件，滅菌丹的檢測線性范圍5～200 ng/mL，回收率93.6%～102.3%，RSD 0.5%～7.3%。結果表明：該方法簡便快速、結果準確，適用于蘋果中滅菌丹殘留量的測定。

關鍵詞 蘋果;滅菌丹;超高效液相色譜串聯(lián)質譜;穩(wěn)定性

滅菌丹（folpet），化學名稱N-三氯甲硫基鄰苯二甲酰亞胺，是苯二甲酰亞胺的衍生物，屬于三氯甲硫基類殺菌劑。作為廣譜、高效的殺菌劑，滅菌丹可用于果樹、蔬菜中多種病害的防治，其滅殺效果好、藥害小，適當使用還有刺激植物生長的作用[1-2]，廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但是，美國環(huán)境保護署（EPA）公布的已評估致癌可能性的農(nóng)藥中，滅菌丹屬于可能的人類致癌物（c類）[3]。張業(yè)鵬[4]的DNA結合試驗結果顯示，滅菌丹或中間產(chǎn)物可以嵌插進DNA雙螺旋中，柳云恩[5]等通過試驗確定了95%滅菌丹原藥對SD大鼠的毒性作用，并得出前胃為潛在的毒性靶器官。因此，各國都對滅菌丹在水果蔬菜中的殘留量規(guī)定了最低的限量，我國現(xiàn)行標準GB 2763-2016[6]對蘋果中滅菌丹的最大殘留量規(guī)定為10 mg/kg。

滅菌丹的檢測方法主要有薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯(lián)用法和液質聯(lián)用法等[7-11]。目前，滅菌丹的國家標準檢測方法通常用GB/T 20769-2008和GB/T 20770-2008，均為液質聯(lián)用法[12-13]。QuEChERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術，2003年由美國農(nóng)業(yè)部開發(fā)[14]。本文在GB/T20769的基礎上，改用QuEChERS法為前處理，依據(jù)滅菌丹的化學性質特點優(yōu)化了流動相組成和質譜條件，極大地提升了檢驗效率和檢驗結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備

Waters Vevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（UPLC-MS/MS）、IKA⑧T25均質器、Eppendorf5804R臺式冷凍離心機、IKA振蕩器、梅特勒精密天平（XS205D/CP225D）。

1.1.2 主要試劑及標準品

蘋果（市售），丙酮（默克，色譜級），乙酸（默克，色譜級），甲酸（默克，色譜級），乙腈（默克，色譜級），水為超純水，PSA（美國艾杰爾科技有限公司），氯化鈉（廣試，AR，用前150℃烘6 h），醋酸鈉（廣試，AR），無水硫酸鎂（廣試，AR，用前500℃馬弗爐內(nèi)烘6h），陶瓷均質子（Agilent公司）。

農(nóng)藥標準品：滅菌丹（99.0%，DR，Ehrenstorfer。

取滅菌丹對照品適量，用丙酮溶解，配制成濃度為1mg/mL的滅菌丹標準儲備液，置于0～4℃避光貯藏。用乙腈配制濃度為1.0μg/mL標準中間液。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

準確稱取10 g勻漿后的蘋果樣品置于50 mL離心管中，加入2粒陶瓷均質子，10mL乙酸乙腈溶液（1：99），渦旋振蕩2min，置于-20℃冰箱冷凍20min，加入4g無水硫酸鎂和1g醋酸鈉，1g氯化鈉，渦旋振蕩2min，離心5min （4℃，5000 r/min），準確吸取6 mL上清液，放人事先裝有400 mg PSA，1200 mg無水硫酸鎂的15 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，置于冷凍離心機中離心5min（4℃，5 000 r/min），取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取濾液，待上機檢測。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 超高效液相條件

色譜柱AcQuity UPLC C18 （1.7μm， 2.1mm×50mm）;流動相乙腈（A）-流動相0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～0.5 min， 10%A;0.5～2.0min， 10%-75%A;2.0-4.0min，75%A;4.0～4.1 min， 75%～10%A;4.1～6.5 min，10% A）流速0.3 mL/min;柱溫40℃;進樣量1μL。

1.2.2.2 質譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESIT）;掃描方式：多反應監(jiān)測（WIRM）;毛細管電壓3.0KV;離子源溫度150℃;脫溶劑氣氮氣流量1000 L/Hr、溫度400℃;錐孔氣氮氣流量150 L/Hr;碰撞氣氬氣流量0.15mL/min。滅菌丹離子信息見表1，滅菌丹離子圖見圖1。

2 結果與分析

2.1 滅菌丹溶液穩(wěn)定性試驗（配制溶劑：甲醇）

滅菌丹，室溫下難溶解于水（1.0mg/L， 25℃），微溶于有機溶劑，純品在干燥條件下較穩(wěn)定，室溫下遇水緩慢水解，遇高溫或堿性物質迅速分解[15]。國標GB/T 20769-2008使用甲醇為溶劑配制標準溶液，但在實際檢測工作中，連續(xù)監(jiān)測了滅菌丹在甲醇中的響應值，檢測結果見圖2。實驗結果顯示，使用甲醇為溶劑配制的滅菌丹標準溶液以及樣品溶液的響應值往往隨著時間變化迅速降低。

2.2 滅菌丹配制溶劑的比較

使用多種溶劑配制滅菌丹標準溶液，通過在常溫下（25℃）放置2h，24h檢測其響應值變化來研究滅菌丹的穩(wěn)定性，詳見表2。

結果顯示，使用不同溶劑配制的滅菌丹標準溶液儀器響應值有較大差異，甲醇、乙腈/水（10：90）V/V溶劑的響應值最低，乙腈及乙腈/0.1%甲酸水（60：40）V/V響應值較高。在2h以內(nèi)，甲醇、乙腈/水（10：90） V/V溶劑中的滅菌丹不穩(wěn)定。24 h時，各種溶劑中的滅菌丹都有不同程度的分解?？梢姕缇ぴ诩状?、水為主體的溶劑中穩(wěn)定性很差，在乙腈為主體的溶劑中較為穩(wěn)定。此外，pH對滅菌丹穩(wěn)定性影響較大，添加甲酸可以提升滅菌丹的穩(wěn)定性，這與文獻報道的相一致[1]。但是，無論是調節(jié)pH還是使用乙腈作為溶劑，在放置較長時間后（24 h）仍比較容易分解。

2.3 方法學試驗

用空白樣品提取液配制2、5、10、30、50、80、100、200 ng/mL滅菌丹系列標準工作液進行測定。以峰面積A為縱坐標.濃度C （5～200 ng/mL）為橫坐標進行回歸分析，結果表明，當滅菌丹的濃度在5～200 ng/mL時，存在良好的線性關系。用不含滅菌丹的蘋果樣品進行標準添加試驗（添加水平分別為5、10、100 mg/kg），結果詳見表3。

2.4 脫溶劑溫度的優(yōu)化

因為滅菌丹是通過脫氯發(fā)生離子化，如圖3所示。因此溫度升高有利于滅菌丹脫氯，提高離子化效率。其他條件不變，分別在不同的脫溶劑溫度下測定滅菌丹的響應值大小，結果如表4。實驗結果表明滅菌丹在脫溶劑溫度為400℃時響應值最高。

3 討論與結論

從滅菌丹的穩(wěn)定性實驗可以看出，如果在前處理過程中花費的時間過長，或者提取過程中的溶劑不合適，滅菌丹就有可能發(fā)生降解。與QuEChERS方法相比，傳統(tǒng)前處理方法的過程步驟較多，在處理的樣品數(shù)量比較大的情況下花費的時間較長，往往回收率很低。QuEChERS方法簡單，整個前處理過程通?？梢栽?～2h完成，以乙酸酸化的乙腈作為提取溶劑，不僅提升了滅菌丹的穩(wěn)定性，而且可以獲得比較準確的結果。依據(jù)滅菌丹的化學性質特點優(yōu)化了流動相組成和質譜條件，本文建立了蘋果中滅菌丹殘留量的檢測方法，即QuEChERS前處理方法聯(lián)合UPLC-MS/MS檢測。本方法靈敏度高，定性定量準確，實驗前處理簡單快速，可有效地滿足蘋果中滅菌丹農(nóng)藥殘留檢測的要求，極大地提升了檢驗效率和檢驗結果的準確性，為相關國家標準的修訂提供了可靠的技術支撐。

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