孫珊珊, 朱麗君, 胡延喜, 劉玉峰,2*, 徐 亮,2*

(1. 遼寧大學藥學院, 遼寧 沈陽 110036; 2. 遼寧省天然產物制藥工程技術研究中心, 遼寧 沈陽 110036)

近年來,隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,鎮(zhèn)靜劑和β-受體激素類藥物被廣泛用作畜禽飼料添加劑,以獲得非法利益。鎮(zhèn)靜劑是一類對中樞神經系統(tǒng)有抑制作用的藥物,在動物飼養(yǎng)過程中可作為麻醉劑和止痛劑減輕或消除動物的狂躁不安和興奮,使其恢復安靜,便于工作或治療[1],近年來,一些不法飼料生產企業(yè)在利益的驅使下,擅自在畜禽飼料中添加此類藥物以達到催眠、增重催肥、縮短出欄時間的目的,或在運輸過程中使用此類藥物以減少動物死亡和體重下降等應激反應帶來的損失。β-受體激素類藥物又稱β-興奮劑,俗稱“瘦肉精”,是一種人工合成藥物,主要用于防治人、獸支氣管哮喘和支氣管痙攣,此類物質可以促進體脂分解、增加蛋白質合成、顯著提高動物的瘦肉率,因此被添加至飼料中用作畜禽的促生長劑[2-4],造成以上藥物以其原形和代謝產物的形式最終潛伏在動物源食品中,目前醫(yī)學實驗已證明其殘留會對人的中樞神經系統(tǒng)等造成不良影響,導致過敏性反應,引起體位性低血壓、運動障礙、心悸、肝損害、惡性綜合征,甚至誘變致癌[5-7]。因此許多國家都將此類藥物列為禁用藥物,我國農業(yè)部235號公告已明確規(guī)定氯丙嗪等鎮(zhèn)靜劑和β-受體激素類藥物只允許治療使用,不得在動物源食品中檢出[8],國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、澳大利亞等國家和地區(qū)均對畜肉中鎮(zhèn)靜劑和β-受體激素的檢出和限量值做出了相關規(guī)定[9,10]。但由于鎮(zhèn)靜劑和β-受體激素類藥物品種眾多,且我國飼料生產企業(yè)較多,很難掌握在飼料生產時藥物添加的情況,因此開發(fā)篩查飼料中鎮(zhèn)靜劑和β-受體激素類藥物的方法尤為重要。

目前檢測鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物的方法,包括酶聯免疫法[11]、高效液相色譜法[12]及液相色譜-質譜聯用法[13,14]。酶聯免疫法作為快速檢測的方法可以用于前期篩查,但存在一定的假陽性,無法作為確證方法[3,15]。隨著液相色譜-質譜技術的發(fā)展,液相色譜-串聯質譜法正越來越廣泛地應用于違禁藥物的分析中,其分析范圍廣,背景干擾少,靈敏度高,選擇性強,結果精確可靠,即可定性、又可定量,是對復雜樣本中藥物殘留快速檢測的首選方法[16-19]。針對飼料市場上鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物泛濫使用的現象,本文同時選取這兩類藥物作為研究對象。經文獻檢索,僅見鎮(zhèn)靜劑類[20]和β-受體激素類[3,21]單一類別藥物的報道,尚未發(fā)現對這兩大類藥物同時檢測的報道。本研究利用超高液相色譜-串聯三重四極桿質譜(UHPLC-QqQ-MS)技術,建立了飼料中具有代表性的8種鎮(zhèn)靜劑類和15種β-受體激素類藥物的篩查檢測方法,該分析方法較上述報道[3,20,21]在樣品處理上操作更簡單,分析時間更短,為同時監(jiān)控動物飼料中的鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Agilent 1290-6460液相色譜-串聯質譜儀(Agilent公司); XS303S分析天平(Mettler Toledo公司); Centrifuge 5810R型離心機(Eppendorf公司); T25型均質器(IKA公司); MMV-1000W振蕩器(ETELA公司); N-EVAP氮吹儀(Organomation公司); MS basic渦流混勻器(IKA公司);PCX混合型陽離子交換固相萃取柱(60 mg/3 mL,Agilent公司)。乙腈、甲醇均為色譜純(美國Fisher公司),三氯乙酸、氨水均為分析純(煙臺市雙雙化工有限公司),甲酸為色譜純(美國Tedia公司),水采用GB/T 6682規(guī)定的一級水。

標準物質:8種鎮(zhèn)靜劑類藥物(乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安)、15種β-受體激素類藥物(萊克多巴胺、苯乙醇胺A、齊帕特羅、噴布特羅、班布特羅、妥羅特羅、克倫特羅、沙丁胺醇、馬噴特羅、塞布特羅、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、氯丙那林、鹽酸溴代克倫特羅)和4種內標(氯丙嗪-d6、萊克多巴胺-d3、克倫特羅-d9、沙丁胺醇-d3),均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度均大于95%。

1.2 標準溶液配制

用甲醇配制23種藥物、4種內標的100 mg/L的標準儲備液,避光于4 ℃下保存。系列標準溶液用初始流動相配制,現用現配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

稱取試樣2.0 g,置于100 mL聚丙烯離心管中,加入20 mL乙腈-1%(體積分數,下同)三氯乙酸水溶液(7∶3, v/v)均質提取2 min,然后于10 000 r/min離心10 min,并將上清液全部轉移至新的100 mL離心管中。再加入10 mL乙腈-1%三氯乙酸水溶液(7∶3, v/v),渦旋混合1 min,于10 000 r/min離心10 min,將上清液合并入100 mL離心管,渦旋混合,待凈化。

1.3.2 樣品凈化

混合陽離子交換固相萃取柱在使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 1%(體積分數,下同)甲酸水溶液活化,保持柱體濕潤。將上清液加入到活化后的混合陽離子交換固相萃取柱上,自然重力下流出,依次用5 mL 1%甲酸水溶液、5 mL水、5 mL甲醇淋洗,最后用5 mL氨水-甲醇(5∶95, v/v)洗脫液洗脫至10 mL玻璃管中,在45 ℃水浴中用氮氣吹干。準確加入1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶7, v/v),渦旋溶解,過0.2 μm濾膜,供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 色譜-串聯質譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱:Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脫程序:0～3.0 min, 10%B～30%B; 3.0～5.0 min, 30%B～70%B; 5.0～7.0 min, 70%B～90%B; 7.01 min, 10%B,平衡3 min。柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:20 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子模式ESI(+);掃描方式:多反應監(jiān)測(MRM)掃描;干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:10 L/min;噴霧針壓力:275.8 kPa;電子倍增器電壓:4 000 V;碰撞氣:氮氣,純度99.999%。

1.4.3 定量

8種鎮(zhèn)靜劑類藥物以氯丙嗪-d6為內標，15種β-受體激素類藥物以萊克多巴胺-d3、克倫特羅-d9、沙丁胺醇-d3為內標，具體見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

對于串聯質譜,一個母離子和兩個特征子離子即可滿足質譜確證的需要。在本實驗中,分別將8種鎮(zhèn)靜劑類和15種β-受體激素類藥物及4種內標的標準儲備液配成一定濃度的標準溶液,不接色譜柱,直接進行質譜分析。首先在正離子模式下進行全掃描,確定化合物的分子離子,即為母離子。用高純氮氣作為碰撞氣體,選取干擾較小、豐度較強的子離子作為定性和定量離子,即特征子離子。同時優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量,23種目標物及4種內標的質譜參數優(yōu)化結果見表1。

表 1 8種鎮(zhèn)靜劑類、15種β-受體激素類藥物和4種內標的質譜參數Table 1 MS parameters of eight sedatives, fifteen β-receptor hormones and four internal standards

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

* Quantitative ion. Quantitative internal standard: 1) chlorpromazine-d6; 2) ractopamine-d3; 3) clenbuterol-d9; 4) salbutamol-d3.

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取液的選擇

動物源食品中β-受體激素類藥物與組織結合,需要通過蛋白酶酶解的方式提取出來[22,23],飼料樣品中β-受體激素類藥物主要以原形態(tài)存在,因此在提取飼料樣品過程中未加入酶解試劑。鎮(zhèn)靜劑類藥物在動物體內除以原形態(tài)藥物存在以外還可能以代謝物形式存在,但飼料當中主要檢測其原形態(tài)藥物[24]。

提取試劑的選擇在樣品前處理過程中至關重要,不僅要考慮萃取效率,還要盡可能使其他基質或雜質干擾物不溶解或少溶解,本實驗選取了獸藥殘留檢測常用的有機溶劑作為提取試劑(主要包括乙酸乙酯、乙腈、甲醇),選取相同的飼料樣品,分別添加相同濃度的標準物質,以外標法比較其回收率,結果表明:乙酸乙酯74.6%～81.7%,乙腈80.3%～86.9%,甲醇79.6%～84.1%。飼料的樣品基質較為復雜,考慮到飼料樣品中蛋白質的含量較高,在提取試劑中加入1%三氯乙酸能夠更好地起到沉淀蛋白的作用,通過試驗比較,乙腈較其他兩種試劑藥物提取效率更高,因此對比優(yōu)化后用乙腈-1%三氯乙酸水溶液(7∶3, v/v)作為提取液。

2.2.2 凈化條件的選擇

飼料成分較為復雜,各種雜質含量較高,對檢測影響很大。鎮(zhèn)靜劑類藥物在GB 20763-2006中采用液液萃取的方式凈化,β-受體激素類藥物凈化在文獻[21,25]報道中主要有強陽離子交換柱凈化、C18柱凈化、QuEChERS方法凈化。相對于傳統(tǒng)的凈化方式,強陽離子交換柱凈化效率高,提高了濃縮倍數,降低了檢出限[26,27]。本實驗選取相同的待凈化樣品,利用外標法對上述4種凈化方法進行比較,檢測藥物的回收率,結果如下:強陽離子交換柱82.1%～87.4%, C18柱77.6%～82.7%, QuEChERS方法74.5%～80.1%,液液萃取69.0%～74.3%。因此在選擇凈化方面最終選用強陽離子交換柱凈化。本實驗比較了甲酸水溶液、水、甲醇、氨水-甲醇作為淋洗液和洗脫液的凈化效果,結果表明,按照5 mL 1%甲酸水溶液、5 mL水和5 mL甲醇的順序進行淋洗,凈化效果好,5 mL氨水-甲醇(5∶95, v/v)作為洗脫液回收率高。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類部分藥物在極性方面相近,因此色譜分離方面要盡可能選擇合適的色譜柱,以提高分離速度和靈敏度。在色譜柱的選擇性方面,分別比較了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18系列1.8 μm填料的色譜柱(50 mm×2.1 mm、100 mm×2.1 mm、100 mm×3.0 mm)以及C18與C8(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)兩種相同規(guī)格、不同性質的色譜柱。結果表明,規(guī)格為100 mm×3.0 mm, 1.8 μm的C18色譜柱柱效更高,分離效率、靈敏度更好。同時,選用的0.3 mL/min的柱流速與本實驗中電噴霧離子化方式所要求的流速也具有良好的匹配。

2.3.2 流動相的選擇

為獲得最佳的分辨率和靈敏度,分別比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸銨、甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液6種流動相配比方式,最終發(fā)現,在ESI(+)方式下,在甲醇-0.1%甲酸水溶液組成的流動相中,質譜的離子化效率優(yōu)于其他試劑,因此本文選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。通過調整流動相比例,進行梯度洗脫。在本文的液相色譜條件下,23種化合物的總離子流色譜圖(TIC)和多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1。

圖 1 目標物的總離子流色譜圖和多反應監(jiān)測色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram (TIC) and multiple reaction monitoring chromatograms of the targets

圖 1 (續(xù))Fig. 1 (Continued)

圖 1 (續(xù))Fig. 1 (Continued)

AnalyteLinearequationr2LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Recoveries/%(n=6)5.0μg/kg10μg/kg50μg/kgRSDs/%(n=6)5.0μg/kg10μg/kg50μg/kgAcetopromaiziney=0.676x+0.0030.999131.13.081.287.884.66.86.27.7Chlorpromaziney=0.819x-0.0060.999330.72.091.390.289.76.810.211.7Haloperidoly=24.403x+0.6670.999131.23.086.484.288.712.711.914.3Propionylpromaziney=40.323x+0.1140.999521.33.090.991.292.37.98.79.3Xylaziney=9.047x+0.1980.999001.23.086.789.888.94.65.87.2Azaperoney=0.473x-0.0070.999321.13.086.187.685.89.210.28.7Azaperoly=0.570x-0.0010.999331.13.091.189.693.48.79.17.8Carazololy=0.433x+0.0080.999721.33.091.789.186.29.610.28.7Ractopaminey=11.979x+0.5100.999170.72.092.394.791.89.68.58.1PhenylethanolamineAy=49.604x+1.5420.999821.96.078.477.178.710.18.911.2Zilpateroly=5.822x+0.3750.998920.93.089.490.287.98.98.27.9Penbutololy=18.322x+0.3800.999661.03.084.385.686.15.26.86.0Bambuteroly=15.117x+0.1130.999860.93.090.291.694.79.68.710.2Tulobuteroly=25.523x+0.0630.999411.03.091.499.698.18.68.19.7Clenbuteroly=13.640x+1.5160.999300.51.599.8102.4100.14.36.25.0Salbutamoly=20.965x+0.6880.999760.61.596.898.6101.46.46.15.9Mapenteroly=21.285x+0.7490.999290.93.096.192.194.811.210.89.7Cimbuteroly=1.836x+0.1130.999560.83.079.678.475.18.99.89.9Terbutaliney=18.991x+0.0490.999810.73.096.498.693.76.28.77.6Mabuteroly=20.075x+0.7860.999890.83.089.190.792.89.69.910.8Brombuteroly=7.746x+0.0140.999541.03.077.879.680.76.45.97.1Clorprenaliney=0.473x-0.0070.999331.13.092.993.890.75.65.86.0Bromchlorbuteroly=10.563x+0.5620.999411.23.080.177.976.211.210.010.3

y: peak area ratio of analyte to the internal standard;x: mass concentration of analyte, μg/L.

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

以各物質定量離子峰面積與相應內標物定量離子峰面積的比值為縱坐標，被測組分的質量濃度為橫坐標，分別繪制標準曲線,得到鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物的線性方程、相關系數(r2)、檢出限和定量限,結果見表2。由表2可知,23種目標物在2.0～200.0 μg/L內線性關系良好,相關系數均大于0.99。

2.5 準確度和精密度試驗

以空白飼料為樣品,在5.0、10、50 μg/kg 3個水平下進行加標回收試驗,每個樣品重復測定6次,考察本方法的準確度和精密度,結果見表2。飼料中鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物的平均回收率為75.1%～102.4%,相對標準偏差(RSD)為4.3%～14.3%(n=6)?；厥章屎途芏鹊染鶟M足分析要求。

2.6 實際樣品測定

用本方法對從市場上抽檢的10份飼料樣品進行檢測,均為陰性樣品。

3 結論

本文建立了同時測定飼料中8種鎮(zhèn)靜劑類和15種β-受體激素類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜法,并對樣品的前處理條件和分析條件進行了優(yōu)化。本實驗在樣品凈化時采用強陽離子交換柱,使得被檢測的藥物回收率更高,檢出限和定量限更低,液相色譜-串聯質譜的檢測條件使樣品的分析時間也更短。因此可認為該方法對飼料中殘留的藥物具有提取率高、選擇性強、靈敏度高、篩選速度快等優(yōu)點。隨著人們對食品安全關注度的增加,對畜產品及其飼料中添加的有毒有害物質的篩查也會越來越重視。該方法實現了對飼料中多種鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物的同時分析檢測,為檢測飼料中鎮(zhèn)靜劑類和β-受體激素類藥物殘留提供了技術支持。

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