柴爽爽, 馬有寧, 高歡歡,2, 秦美玲,楊 歡, 張涵彤, 何 巧, 林曉燕*

(1. 中國(guó)水稻研究所, 農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心, 農(nóng)業(yè)部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310006; 2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 杭州 310014)

鳥(niǎo)槍法是將蛋白質(zhì)酶解消化得到蛋白質(zhì)多肽片斷并利用質(zhì)譜測(cè)定肽序的策略,是分析復(fù)雜蛋白質(zhì)組學(xué)的有力工具[1,2]。水稻蛋白質(zhì)的提取是水稻蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟[3]。與擬南芥和其他的有機(jī)體蛋白質(zhì)組分析相比,水稻蛋白質(zhì)組分析存在很多問(wèn)題。因?yàn)樗窘M織中包含大量的次級(jí)物質(zhì)如酚類(lèi)、脂肪、有機(jī)酸、糖類(lèi)、萜烯和色素等[4-6],當(dāng)這些次級(jí)物質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生共沉淀時(shí),會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)組分析造成嚴(yán)重的干擾作用[7,8]。因此,為了得到植物組織中的全蛋白,選擇高效的提取方法非常必要。

近年來(lái),多維液相色譜分離技術(shù)迅速發(fā)展。其中二維液相色譜(2D LC)是鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組研究的主流方法,不僅補(bǔ)充了雙向電泳技術(shù)本身存在的分離蛋白質(zhì)范圍有限、存在歧視效應(yīng)以及無(wú)法與質(zhì)譜直接聯(lián)用等缺陷[9,10],也彌補(bǔ)了一維分離模式峰容量低、分辨率低、分離能力差的局限性[11]。目前,二維液相色譜已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域的蛋白質(zhì)組研究,如人體血清[12]、中藥[13-15]、聚合物[16]、小麥[10]、黑楊[17]、擬南芥[18]等。因?yàn)樾枰獪p少一維液相色譜組分中的乙腈且消除高鹽濃度對(duì)系統(tǒng)魯棒性的影響[19],離線反相-反相二維液相分離系統(tǒng)成為常用的適用于蛋白質(zhì)組分析的多維液相色譜分離系統(tǒng)。但迄今尚未見(jiàn)將離線反相-反相二維液相色譜用于水稻器官、組織或亞細(xì)胞水平蛋白質(zhì)組分析的相關(guān)研究報(bào)道。

本文通過(guò)比較水稻葉片蛋白質(zhì)的提取方法(酚法、十二烷基硫酸鈉法(SDS法)和三氯乙酸/丙酮法(TCA/丙酮法))和液相色譜分離系統(tǒng)(一維液相色譜與二維液相色譜)對(duì)水稻葉片蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響,最終建立了以酚法提取、二維液相色譜分離、線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(LTQ/Orbitrap MS)分析水稻葉片蛋白質(zhì)組的方法。本方法有助于更深入地研究水稻葉片蛋白質(zhì)組,并為其他植物葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司), Easy nLC 1000納升級(jí)液相色譜儀和LTQ-Orbitrap組合高分辨質(zhì)譜儀(附納噴霧離子源)(美國(guó)Thermo Fisher公司)、CentriVap?離心濃縮儀(美國(guó)Labconco公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司); PHS-3C精密pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);DK2-28電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與材料

三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、碘代乙酰胺(iodoacetamide, IAA)、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶(trypsin)、KCl、尿素和蛋白酶抑制劑均購(gòu)于Sigma公司;蔗糖(純度≥ 99%)購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸氫銨購(gòu)于Acros Organics公司;甲酸、氫氧化銨購(gòu)于Fluka公司;二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)購(gòu)于Promega公司;20x PBS緩沖液購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;乙腈、甲醇、丙酮購(gòu)于德國(guó)Merck公司;Tris-飽和酚購(gòu)于Sangon公司;以上試劑均為分析純或色譜純。實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水(18.2 MΩ5cm);除鹽固相萃取柱(MILI-SPE extraction disk cartridge, 3 mL, C18-SD小柱)購(gòu)自Agilent公司。

采集齊穗期水稻葉片,用液氮速凍并在-80 ℃冰箱中保存,待用。

1.3 樣品制備

1.3.1 葉片總蛋白質(zhì)的提取及裂解

1.3.1.1 酚法

參考Kilambi等[20]報(bào)道的方法:稱(chēng)取3 g經(jīng)液氮研磨的水稻葉片樣品于50 mL離心管中,加入20 mL 4 ℃預(yù)冷的提取緩沖液(0.1 mol/L KCl, 0.7 mol/L蔗糖,0.5 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 50 mmol/L EDTA),再加入50 μL蛋白酶抑制劑和1 mL 1 mol/L DTT(終濃度為50 mmol/L),振蕩混勻;加入等體積于4 ℃條件下預(yù)冷的pH 7.5的Tris-HCl飽和酚,混勻后于4 ℃振蕩30 min;然后于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min。收集上層酚相,棄去下層水相;在收集的上層酚相中加入等體積的于4 ℃條件下預(yù)冷的提取緩沖液,混勻后于4 ℃條件下振蕩30 min;于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min,收集上層酚相,棄去下層水相,再重復(fù)提取1次;加入5倍體積的預(yù)冷的0.1 mol/L乙酸銨的甲醇溶液,于-20 ℃條件下沉淀過(guò)夜;于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min,棄去上清液;加入2倍體積的預(yù)冷的甲醇(基于最后收集的酚相體積),輕輕混勻,于4 ℃、10 000 g條件下離心15 min,棄去上清液,重復(fù)2次;用預(yù)冷的丙酮替代甲醇,清洗沉淀2次,并將沉淀晾干。在晾干的沉淀中加入1.5 mL蛋白質(zhì)裂解液(8 mol/L尿素、40 g/L 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、40 mmol/L Tris),振蕩混勻使之充分溶解,于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min,上清液即為粗蛋白質(zhì)溶液,于-80 ℃條件下保存。

1.3.1.2 SDS法

參考An等[21]報(bào)道的方法:稱(chēng)取3 g經(jīng)液氮研磨的水稻葉片樣品于50 mL離心管中,加入30 mL PBS緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4),冰浴下高速勻漿超聲30 s,于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min,取上清液;加入適量100 g/L SDS的PBS緩沖溶液,使SDS的最終質(zhì)量濃度為10 g/L(pH 7.0～8.5);加入適量1 mol/L DTT使其終濃度為10 mmol/L,于56 ℃條件下反應(yīng)30 min;加入適量1 mol/L IAA使其終濃度為25 mmol/L,于37 ℃條件下避光30 min;將上述溶液分成5等份,分別逐步加入5倍體積的預(yù)冷丙酮,渦旋振蕩后,于-20 ℃過(guò)夜沉淀;在4 ℃下,以10 000 g離心30 min,棄去上清液;加入等體積的丙酮-水(6∶1,v/v)洗滌,將沉淀自然晾干。在5份晾干的沉淀中分別加入0.3 mL蛋白質(zhì)裂解液(8 mol/L尿素、40 g/L CHAPS、40 mmol/L Tris),振蕩混勻使之充分溶解,于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min,取上清液合并于同一個(gè)2 mL離心管中于-80 ℃條件下保存。

1.3.1.3 TCA/丙酮法

參考Ippoushi等[22]報(bào)道的方法:稱(chēng)取3 g經(jīng)液氮研磨的水稻葉片樣品于50 mL離心管中,加入30 mL于4 ℃條件下預(yù)冷的TCA提取液(100 g/L TCA/丙酮溶液)和1.5 mL 1 mol/L DTT(終濃度為50 mmol/L);振蕩混勻,于-20 ℃條件下沉淀過(guò)夜;于4 ℃、10 000 g條件下離心30 min,棄去上清液;于收集的沉淀中加入20 mL預(yù)冷的丙酮,并輕輕混勻;于4 ℃、10 000 g條件下離心20 min。重復(fù)上述步驟兩次;收集沉淀并將沉淀晾干。蛋白質(zhì)裂解及保存同酚法。

1.3.2 蛋白質(zhì)定量

以Bradford法[23]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,采用BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蛋白質(zhì)的酶解

取適量(一維液相色譜取100 μg,二維液相色譜取2 mg)的粗蛋白質(zhì)樣品放入離心管中,加入1 mol/L DTT溶液至其終濃度約為10 mmol/L,將上述離心管恒溫在37 ℃條件下反應(yīng)2.5 h;加入適量1 mol/L的IAA至終濃度為50 mmol/L,室溫,避光40 min;用50 mmol/L NH4HCO3溶液定容使尿素終濃度小于2 mol/L,按m(酶)∶m(蛋白質(zhì))=1∶50的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃水浴條件下酶解過(guò)夜(16～20 h);加入甲酸溶液,終止反應(yīng)。

1.3.4 脫鹽

將C18-SD固相萃取柱裝入15 mL離心管中,加入1 mL甲醇于1 500 g條件下離心1 min,加入0.5 mL 70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈水溶液(含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸), 以1 500 g離心1 min;加入0.5 mL 0.1%甲酸,以1 500 g離心1 min;上樣,以150 g離心3 min;加入0.5 mL 0.1%甲酸水溶液,以150 g離心3 min;將固相萃取小柱取出,裝入新的離心管,加入0.5 mL 70%乙腈水溶液(含0.1%甲酸),以150 g離心3 min,重復(fù)一次;洗脫液即為脫鹽肽段,將洗脫液離心濃縮。一維液相色譜分析時(shí),用100 μL 0.1%甲酸水溶液溶解,以10 000 g離心30 min,取上清液用于納升級(jí)液相色譜-LTQ-Orbitrap組合高分辨質(zhì)譜儀檢測(cè)。二維液相色譜分析時(shí),用100 μL 5 mmol/L氫氧化氨溶解,于10 000 g條件下離心30 min,取上清液用Agilent 1200型高效液相色譜儀進(jìn)行組分收集,收集的組分經(jīng)離心濃縮后溶于100 μL 0.1%甲酸水溶液中,用于第二維液相色譜(納升級(jí)液相色譜)分離,并用LTQ-Orbitrap組合高分辨質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.4 儀器條件

1.4.1 高效液相色譜

第一維液相色譜采用xBridge Peptide BEH C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相A為5 mmol/L氫氧化銨,流動(dòng)相B為90%乙腈水溶液(含5 mmol/L氫氧化銨);檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量50 μL。多肽洗脫梯度:0～5 min, 0～2%B; 5～10 min, 2%B ～5%B; 10～70 min, 5%B ～25%B; 70～75 min, 25%B ～40%B; 75～85 min, 40%B～70%B; 85～95 min, 70%B。從第11 min開(kāi)始收集,每隔10 min收集一次,最終收集10個(gè)組分。

1.4.2 納升級(jí)液相色譜

色譜分析柱為Acclaim Pep Map RSLC(C18, 15 cm×50 μm, 2 μm);預(yù)柱為Acclaim Pep Map 100(C18, 2 cm×75 μm, 3 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈。多肽梯度洗脫:0～120 min, 0～65%B; 120～140 min, 65%B～95%B; 140～160 min, 95%B。流速為300 nL/min;進(jìn)樣量為2 μL。

1.4.3 LTQ-Orbitrap質(zhì)譜分析

設(shè)置電噴霧電壓為1.9 kV,離子傳輸毛細(xì)管溫度為300 ℃。以數(shù)據(jù)依賴(lài)模式進(jìn)行MS/MS圖譜采集。一級(jí)質(zhì)譜采用Orbitrap采集,掃描范圍為m/z300～20 000,分辨率設(shè)為60 000;對(duì)全掃描中豐度最高的前10個(gè)離子峰用LTQ進(jìn)行二級(jí)碎片采集,裂解模式為碰撞誘導(dǎo)解離,歸一化碰撞能量為35%,離子活化時(shí)間為30 ms。動(dòng)態(tài)排除設(shè)置:重復(fù)次數(shù)為1,重復(fù)間隔時(shí)間為60 s,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30 s。采用Xcalibur軟件(Version 2.07, Thermo公司)進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。

1.4.4 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)采用Proteome Discoverer (Version 2.0.0.802, Thermo公司)分析,在水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Oryza sative subsp.japonica(Rice).fasta)中進(jìn)行檢索;酶切方式設(shè)置為胰蛋白酶全酶切,最高允許兩個(gè)漏切位點(diǎn);設(shè)定半胱氨酸殘基C端為固定修飾+57 Da, Met(M)為動(dòng)態(tài)修飾+15.995 Da;前體離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為20 ppm(10-6),碎片離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為0.6 Da。假陽(yáng)性率控制在1%以?xún)?nèi),以此獲取更為可靠的鑒定結(jié)果。

圖 1 不同提取方法提取的蛋白質(zhì)在一維和二維液相色譜條件下鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目比較Fig. 1 Comparison of the number of proteins identifiedby 1D LC and 2D LC followed the extraction with three different methods a, b, c represent phenol method, SDS method and TCA/acetone method, respectively. Smaller circles represent one-dimensional liquid chromatography (1D LC), and larger circles represent two-dimensional liquid chromatography (2D LC).

2 結(jié)果與討論

2.1 不同色譜分離系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響

水稻葉片蛋白質(zhì)經(jīng)酚法、SDS法和TCA/丙酮法提取后,分別用一維液相色譜分離系統(tǒng)和二維液相色譜分離系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。在一維液相色譜條件下,酚法、SDS法和TCA/丙酮法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目分別是988、966和975,雖然酚法比其他兩種方法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目多,但3種方法鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目差別不大。但在二維液相色譜條件下,酚法、SDS法和TCA/丙酮法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目分別為2 712、2 415和1 914,分別是一維液相色譜條件下鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目的2.7、2.5和1.9倍。圖1分別為酚法、SDS法和TCA/丙酮法提取的蛋白質(zhì)經(jīng)一維和二維液相色譜分離后鑒定到的蛋白質(zhì)所做的韋恩圖。由圖1可見(jiàn),一維液相色譜鑒定到的蛋白質(zhì)基本上在二維液相色譜中也可以鑒定到,且二維液相色譜中可以鑒定到多種一維液相色譜中不能鑒定到的新的蛋白質(zhì)。以上結(jié)果說(shuō)明二維液相色譜分離水稻葉片蛋白質(zhì)有明顯的優(yōu)越性,主要原因是一維液相色譜系統(tǒng)提供的峰容量和分辨率難以滿(mǎn)足高效分離的要求[24],而二維液相色譜系統(tǒng)先后對(duì)肽段混合物進(jìn)行2次分離,大大提高了系統(tǒng)的分辨率和峰容量[25,26],有利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)[3,10]。

2.2 二維液相色譜條件下不同蛋白質(zhì)提取方法對(duì)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響

在二維液相色譜條件下,酚法鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目最多,高達(dá)2 712,分別比SDS法和TCA/丙酮法多鑒定出297和798個(gè)蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖1)。因此,酚法為最佳的水稻蛋白質(zhì)提取方法,此結(jié)果與Kilambi等[3]的研究結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)樗救~片中的干擾物質(zhì)進(jìn)入水相而蛋白質(zhì)保留在酚相,兩相分離后,使酚法產(chǎn)生最佳的蛋白質(zhì)提取效果[27]。而SDS法和TCA/丙酮法因蛋白質(zhì)沉淀不充分而造成蛋白質(zhì)損失[2,3],且有報(bào)道指出TCA/丙酮法能夠使多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生共沉淀[28],對(duì)下游的蛋白質(zhì)組分析造成嚴(yán)重的干擾。

圖 3 3種蛋白質(zhì)提取方法鑒定到的蛋白質(zhì)功能種類(lèi)的韋恩圖Fig. 3 Venn diagram of the identified protein functionalcategories by three different extraction methods

2.3 不同蛋白質(zhì)提取方法對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)和等電點(diǎn)(pI)分布的影響

蛋白質(zhì)的Mr和pI含有生物學(xué)與病理學(xué)中生物標(biāo)記物和信號(hào)分子的重要信息[29],因此在蛋白質(zhì)組學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)Mr和pI的研究引起了廣泛關(guān)注。為此,本文對(duì)酚法、SDS法和TCA/丙酮法在二維液相色譜條件下鑒定到的蛋白質(zhì)按照Mr和pI進(jìn)行分析比較,以反映這3種蛋白質(zhì)提取方法對(duì)不同Mr和pI蛋白質(zhì)的偏好性。

圖 2 3種提取方法鑒定到的蛋白質(zhì)在不同(a)相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間和(b)等電點(diǎn)區(qū)間的分布Fig. 2 Distributions of the identified proteins in differentintervals of (a) relatively molecular mass and (b) pI by three different extraction methods SDS method: sodium dodecyl sulfate method; TCA/acetone method: trichloroacetic acid/acetone method.

圖2a、2b分別是3種蛋白質(zhì)提取方法在二維液相色譜條件下鑒定到的蛋白質(zhì)在不同Mr和pI區(qū)間的數(shù)目。由圖2可見(jiàn),3種蛋白質(zhì)提取方法所鑒定蛋白質(zhì)的Mr和pI占各自蛋白質(zhì)鑒定總數(shù)的比例總體上沒(méi)有明顯差異。鑒定到的水稻葉片蛋白質(zhì)的Mr主要集中在10～70 kDa,pI主要集中在5～10。從等電點(diǎn)的分布可以看出,酚法在不同pI區(qū)間鑒定到的蛋白質(zhì)均多于SDS法和TCA/丙酮法。與SDS法和TCA/丙酮法相比,酚法能夠鑒定到一些酸性、堿性及高等電點(diǎn)極端蛋白質(zhì),如等電點(diǎn)值為11.43的核糖體蛋白L36(Q6L510)。因此,酚法對(duì)不同等電點(diǎn)區(qū)間的蛋白質(zhì)均有較好的提取效果,而SDS法和TCA/丙酮法對(duì)不同等電點(diǎn)區(qū)間的蛋白質(zhì)造成了不同程度的損失。

2.4 水稻葉片蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及功能分析

水稻葉片蛋白質(zhì)在酚法、SDS法和TCA/丙酮法提取條件下,酶解肽段經(jīng)二維液相色譜分離系統(tǒng)分離和高分辨質(zhì)譜分析,再經(jīng)Protein Discover 2.0.0.802軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,可鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目分別為2 712、2 415和1 914,其中肽段≥2的蛋白質(zhì)各有1 905、1 661、1 247個(gè),分別占其總數(shù)的70.2%、68.7%和65.1%。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肽段≥2的蛋白質(zhì)按代謝功能途徑中基因的功能及其位置進(jìn)行分類(lèi),酚法、SDS法和TCA/丙酮法鑒定到的蛋白質(zhì)種類(lèi)分別有25、23和22種(見(jiàn)圖3),可以看出,3種方法鑒定到的蛋白質(zhì)種類(lèi)存在互補(bǔ)性,但酚法鑒定到的蛋白質(zhì)種類(lèi)最多。

圖4為酚法鑒定到的25種功能種類(lèi),包括光合作用活性、結(jié)合活性、酶活性、轉(zhuǎn)移運(yùn)輸活性、生物合成活性、類(lèi)囊體活性等。其中,具有結(jié)合活性的蛋白質(zhì)最多,這些蛋白質(zhì)可與三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)、金屬離子(鎂離子、銅離子、鈣離子)結(jié)合。ATP結(jié)合蛋白的主要功能是利用ATP水解產(chǎn)生的能量促進(jìn)與其結(jié)合的底物進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),其轉(zhuǎn)運(yùn)底物包括糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物和藥物等[30]。GTP結(jié)合蛋白通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP)和在細(xì)胞膜中結(jié)合GTP的構(gòu)象轉(zhuǎn)換來(lái)完成囊泡分泌和運(yùn)輸?shù)淖饔肹31]。金屬離子在蛋白質(zhì)中的生物功能多種多樣,主要包括結(jié)構(gòu)維持、電子轉(zhuǎn)移、分子識(shí)別與催化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控等[32]。金屬離子的存在對(duì)于維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,保持其生理活性等方面具有極其重要的意義。因此,水稻葉片蛋白質(zhì)中鑒定到的具有結(jié)合活性的蛋白質(zhì)與水稻的生命活動(dòng)具有密切的相關(guān)性。

圖 4 酚法提取的水稻葉片蛋白質(zhì)按代謝功能途徑中基因的功能及其位置分類(lèi)情況Fig. 4 Distribution of the proteins in rice leaves extracted by phenol method according to the classification of the gene functions and positions in metabolic pathway

3 結(jié)論

本文建立了酚法提取-二維液相色譜系統(tǒng)分離-高分辨質(zhì)譜鑒定水稻葉片蛋白質(zhì)的方法。比較了水稻葉片的提取方法(酚法、SDS法和TCA/丙酮法)和液相色譜分離系統(tǒng)(一維液相色譜與二維液相色譜)對(duì)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響,結(jié)果表明,與SDS法和TCA/丙酮法相比,酚法能夠鑒定到一些極端蛋白質(zhì),如酸性、堿性及高等電點(diǎn)蛋白質(zhì)。對(duì)二維液相色譜條件下酚法、SDS法和TCA/丙酮法提取的蛋白質(zhì)按代謝功能途徑中基因的功能及其位置進(jìn)行分類(lèi),發(fā)現(xiàn)3種方法鑒定到的蛋白質(zhì)種類(lèi)存在互補(bǔ)性,但酚法鑒定到的蛋白質(zhì)種類(lèi)最多。本方法為水稻蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了技術(shù)支撐,同時(shí)也為其他作物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)提供重要的借鑒。

[1] Liu Y J. [PhD Dissertation]. Wuhan: Huazhong Agricultural College, 2014: 7

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