白 云，朱瑞超，李 晉，馬 琳，何 俊，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學，天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 300193）

金花葵為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，別名菜芙蓉或野芙蓉[1]。野生金花葵是生長在深山懸崖間的瀕?；ɑ埽饕植荚诤颖钡貐^(qū)[2]。金花葵含有黃酮類化合物、不飽和脂肪酸、維生素E及鋅、硒、鐵人體必需微量元素等，其中黃酮類化合物是其主要的活性成分并且含量超出目前黃酮生產(chǎn)常用原料銀杏、大豆等數(shù)十倍[3-5]。張路等[6]利用索式提取法分離提取并用紫外分光光度法測得金花葵根莖中總黃酮含量為2．72%。宋琳琳等[7]利用超聲波提取并用比色法測得金花葵花中總黃酮含量為8．47%。金花葵具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂等功效；花蕾泡水飲用可擴張血管；根、莖、葉粉碎后過篩制成的面粉具有很高的營養(yǎng)價值；嫩果富含植物雄激素，具有滋陰壯陽等功效[8-10]。它被認為在200多種秋葵植物中最具藥用、食用、保健價值。

目前，除明朝《順德府志》中記載順德府有特產(chǎn)植物金花葵外，在各版《中華人民共和國藥典》及衛(wèi)生部藥品部頒標準中未見收載。其化學成分測定指標比較單一，除金絲桃苷外其他黃酮類成分的質(zhì)量分析未見報道，含量測定的方法主要是傳統(tǒng)高效液相色譜法[11-12]。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC色譜法），同時測定金花葵花中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素的含量，比較不同產(chǎn)地及不同花期樣品含量差異，以評價金花葵花的質(zhì)量，為今后的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AX205十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BP121S萬分之一天平（德國Sartorius公司）；SB-1000YDTD超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FW135型粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；3K15型高速離心機（美國Sigma公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 實驗材料 金花葵花購買自不同產(chǎn)地，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學馬琳教授鑒定為錦葵科秋葵屬植物金花葵（Hibiscus manihot L．）的干燥花,保存于天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院。金花葵花經(jīng)粉碎機粉碎后過60目篩網(wǎng)，備用。標準品包括蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素純度均大于98%，購自成都德斯特生物科技有限公司。乙腈（Merck公司），甲醇（Merck公司），甲酸（美國ACS恩科化學）均為色譜純。超純水由Mill-QⅡ型超純水機制備（Millipore公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1．7 μm,2．1 mm×100 mm）；保護柱：Waters C18柱（2．1 mm×12．5 mm,5 μm）；流動相 A：乙腈，B：超純水（含 0．1%甲酸）；流速：0．3mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL；檢測波長：360 nm。梯度洗脫程序如下：0～1 min：12%～15%A,1～5 min：15%～16%A,5～7 min：16%～30%A,7～9 min：30%～70%A,9～10 min：70%～95%A,10～11 min：95%～12%A。

2.2 標準品溶液的制備 分別精密稱取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素標準品適量，用85%甲醇溶解配制使其濃度均為1 mg/mL的標準品貯備液，分別吸取各儲備溶液適量配制成含蘆丁50μg/mL，金絲桃苷 300 μg/mL，異槲皮苷 200 μg/mL，楊梅素50 μg/mL，槲皮素25 μg/mL的混合標準品溶液，再用甲醇依次稀釋到合適的濃度，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取金葵花粉末1 g，置于錐形瓶中，加入30 mL 85%甲醇溶液，稱質(zhì)量，超聲波提取25 min，補足質(zhì)量，所得溶液14 000 r/min離心 10 min，取上清液，作為供試品溶液（n=3），取上清液稀釋5倍后進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線及線性范圍 本實驗采用外標法同時測定金花葵花中5個化合物的含量。將混合標準品儲備液用85%甲醇稀釋成8個不同濃度的混合標準品溶液，并按上述色譜條件依次進樣2 μl，以濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標制作標準曲線。以信噪比S/N為3∶1作為其檢測限（LOD），S/N為10∶1作為其定量限（LOQ）。5個化合物的標準曲線、LOD與LOQ結果見表2，從表中可以得知，該5個化合物在各自線性范圍內(nèi)相關系數(shù)r2≥0．999，表明5個化合物在其線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

表1 金花葵花中5種化學成分的線性范圍，LOD、LOQTab.1 Calibration curves,linearity range,LOD and LOQ of five flavonoids in flowers of Aurea helianthus

2.4.2 精密度實驗 配制低、中、高3個濃度的混合標準品溶液，分別在同1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次作為日內(nèi)精密度的考察，連續(xù)3 d分別進樣6次作為日間精密度的考察。計算此5個化合物峰面積的相對標準偏差（RSD）值。并且根據(jù)標準曲線計算5個化合物的濃度值，將測得的濃度值與實際濃度值進行比較，得到各化合物的準確度。日內(nèi)與日間精密度試驗結果見表2，各化學成分的峰面積RSD均小于5%表明該儀器精密度良好。

表2 金花葵花中5種化學成分的日內(nèi)精密度及日間精密度（n=6）Tab.2 Results of accuracy and precision of five flavonoids in flowers of Aurea helianthus(n=6)

2.4.3 重復性實驗 取同一批次的金花葵花粉末，按照上述樣品溶液制備方法平行提取6份，連續(xù)進樣分析，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素5種化合物峰面積的RSD值分別為2．38%、2．80%、2．80%、4．11%、3．23%，結果表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 將供試品溶液按照上述色譜條件分別在 0、2、4、6、8、12、24 h 內(nèi)進樣測定，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素5種化合物峰面積的 RSD 值分別為 0．61%、2．23%、2．35%、2．10%、0．96%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率 精密稱取同一批次已知含量的金花葵花粉末，并分別精密加入金花葵中各成分含量的100%，此操作平行6份，按照“樣品溶液的制備”項下方法處理并按照上述色譜條件測定，通過公式（測得量-原有量）/加標量×100%，計算各化學成分的平均回收率，結果見表3。

表3 金花葵花中5種化學成分加樣回收率實驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery of five flavonoids in flowers of Aurea helianthus（n=6）

2.5 金花葵花中5種化學成分含量測定 精密稱取金花葵花粉末適量，按照制備供試品溶液的方法制備，樣品稀釋5倍后按照上述的色譜條件進樣分析，5種分析物的分離度良好，圖1為樣品溶液（A）與混合標準品溶液（B）的高效液相色譜圖。根據(jù)上述“標準曲線及線性范圍”所得的回歸方程計算不同批次供試品溶液中5種化學成分的含量，見表4。從表4可知取自河南南陽同一產(chǎn)地不同采收期的樣品，金花葵末期花中5種成分（蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素）的含量明顯高于初期花中5種成分的含量；不同產(chǎn)地相同采收期的樣品中5種含量差異較大；發(fā)現(xiàn)金絲桃苷和異槲皮苷是金花葵中主要黃酮成分，其中金絲桃苷在3．56～10．07 mg/g 范圍之間，異槲皮苷在 2．29 ～5．22 mg/g范圍之間，其他3種成分含量均低于2．5 mg/g。

圖1 金花葵樣品（A）和混合對照品（B）的色譜圖Fig.1 Typical chromatogram,(A)Sample,(B)Mixed reference substances

3 討論

3.1 供試品溶液提取條件的優(yōu)化 本實驗采用超聲波提取法提取金花葵花中黃酮類成分，甲醇溶液作為提取溶劑。選擇料液比、提取時間、甲醇濃度3個因素作為對黃酮類化合物提取有影響的參數(shù)，進行單因素實驗。在其他兩因素不變的前提下，分別考察了不同料液比（g/mL）A（1∶15，1∶25，1∶35，1∶45，1∶55）、不同提取時間 C（20、30、40、50、60 min）以及不同甲醇濃度A（50%，60%，70%，80%，90%）這3個因素對5個化合物提取總量的影響。根據(jù)單因素實驗的結果：當料液比為1∶25時，5種化合物的提取總量最高；當提取時間為30 min時，5種化合物的提取總量最高；當甲醇濃度為80%時，5種化合物的提取總量最高。在此水平左右選取兩個水平即每個因素各選取3個水平，應用正交設計軟件II v3．1，L9（34）正交表設計正交實驗，結果見表5。根據(jù)極差分析，甲醇濃度對金花葵花黃酮類化合物提取影響最大。分別選擇平均數(shù)大的水平A3、B1、C3組合成最優(yōu)水平組合，即精密稱取1 g金花葵花粉末于具塞錐形瓶內(nèi)，加入30 mL 85%甲醇，超聲25 min，對金花葵花進行提取，可作為供試品的最佳提取條件。

表4 金花葵花中5種化合物含量測定結果(n=3)Tab.4 Contents of five flavonoids in flowers of Aurea helianthus(n=3)mg/g

3.2 色譜條件的優(yōu)化 為使5種待測化合物達到最佳的分離效果，本實驗對流動相組成，柱溫，流速等條件進行了考察和優(yōu)化。本文采用乙腈-水梯度洗脫，考察了在水相中加入不同濃度甲酸（0．05、0．1、0．2%）、柱溫（30、35、40 ℃）以及流速（0．2、0．3、0．4 mL/min）。結果表明，流動相為乙腈-0．1%甲酸水、柱溫30℃和流速0．3 mL/min時對金花葵花樣品進行梯度洗脫，各化合物基線分離較好、靈敏度高、峰型較好。

4 結論

本研究建立測定金花葵花中的5種成分蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素的含量的UPLC分析方法。方法學驗證結果表明該方法穩(wěn)定可靠、靈敏度高且分析時間短，在10 min內(nèi)實現(xiàn)了金花葵花5種待測化合物基線分離，適用于金花葵花的定量研究。從含量測定結果可知：不同采收期間，金花葵含量存在差異，其中含量較高的金絲桃苷、異槲皮苷在末期花中的含量約為初期花中的兩倍，可能與金花葵花中的水分含量有關；不同產(chǎn)地間的含量差異可能是由于溫度，濕度等地理氣候不同。此次測定結果可為今后金花葵花的利用提供數(shù)據(jù)支撐。

表5 正交實驗結果（n=3）Tab.5 Results of orthogonal experiments（n=3）

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