吳曉東，張 峰，梁瑞峰

（1.鄭州兒童醫(yī)院，鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004）

肝纖維化是各種病因所致慢性肝病的共同病理過(guò)程，也是向肝硬化發(fā)展的重要中間環(huán)節(jié)[1]。目前普遍認(rèn)為，肝纖維化若能早期發(fā)現(xiàn)并予有效治療，其病理過(guò)程是可被逆轉(zhuǎn)的，而發(fā)展到肝硬化階段則是不可逆的[2]。大黃、丹參在中醫(yī)治療器官纖維化領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，大黃素是大黃的有效成分，具有抗炎抗氧化、保護(hù)肝腎等作用[3]，丹參素是丹參的活性成分之一，具有抗組織缺血、擴(kuò)張血管、抗纖維化等藥理活性[4]，然而未見(jiàn)有這兩種作用機(jī)制不同的有效成分聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠肝纖維化影響的報(bào)道。本研究通過(guò)腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立大鼠肝纖維模型，觀察對(duì)大黃素和丹參素合用對(duì)肝纖維化大鼠的影響，為臨床應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（豫）2015-0004。

1.2 藥品及試劑 丹參素、大黃素（成都曼思特生物科技有限公司）；Masson染色試劑盒，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、羥脯胺酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.3 儀器 Synergy NEO型全功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）；2K15型低溫離心機(jī)（Sigma公司）；CX31型顯微鏡（Olympus公司）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與分組 SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、大黃素組（40 mg/kg）、大黃素丹參素合用低劑量組（大黃素20mg/kg+丹參素20mg/kg）、高劑量（大黃素40 mg/kg+丹參素40 mg/kg）組，每組10只。除空白組腹腔注射橄欖油溶液外，其余各組大鼠均腹腔注射30%四氯化碳橄欖油[5]混懸液（2 mL/kg），每周2次，連續(xù)7周。從第3周開(kāi)始，除注射造模外，各實(shí)驗(yàn)組分別灌胃相應(yīng)的藥物，正常組、模型組灌胃等體積雙蒸水，每日1次，連續(xù)6周。末次給藥后禁食不禁水24 h，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，-20℃保存，取肝臟固定部位10%中性甲醛保存作組織病理學(xué)觀察，另一部分-80℃保存。

2.2 肝臟組織病理學(xué)觀察 肝臟組織經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。Masson染色后，觀察肝組織中膠原纖維沉積情況。纖維化程度分級(jí)見(jiàn)參照文獻(xiàn)[6]：無(wú)明顯膠原纖維增生即表示為“-”；膠原纖維增多，從匯管區(qū)或中央靜脈呈星狀向外延伸，無(wú)纖維隔形成表示為“+”；膠原纖維明顯增多并形成相互不連接的纖維隔表示為“++”；膠原纖維相互連接成完全的纖維隔，分割肝實(shí)質(zhì)表示為“+++”。

2.3 肝功能檢測(cè) 離心分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)微板法檢測(cè)大鼠血清中ALT、AST、ALP的活性，評(píng)價(jià)大鼠肝功能。

2.4 肝纖維化標(biāo)志物檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)大鼠血清中肝纖維化標(biāo)志物L(fēng)N、HA和PCⅢ的水平。精密稱取冷凍保存的肝組織加生理鹽水勻漿，酸水解法檢測(cè)大鼠肝勻漿中HYP的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝組織病理變化 HE染色顯示，空白組大鼠肝索整齊、呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無(wú)變性及壞死，未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肝索斷裂，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯壞死及大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有膠原纖維增粗增厚；大黃素組可見(jiàn)部分肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞排列相對(duì)紊亂，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷程度明顯減輕；合用組肝細(xì)胞排列相對(duì)整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常較少見(jiàn)，HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。Masson染色顯示，空白組肝組織肝索排列整齊，呈條索狀向四周放射狀排列，小葉結(jié)構(gòu)清晰，僅在匯管區(qū)可見(jiàn)少量膠原纖維；模型組肝細(xì)胞排列紊亂，匯管區(qū)和中央靜脈之間膠原纖維明顯增多，形成纖維縱隔，交結(jié)形成完全或不完全假小葉，同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞變性、壞死；大黃組肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，仍可見(jiàn)膠原纖維；合用組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，膠原纖維沉積減少，結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.2 對(duì)大鼠肝功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST和ALP活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，大黃素組、合用低劑量組、高劑量組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與大黃素組相比，合用高劑量組大鼠ALT、AST和ALP水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 對(duì)肝纖維化指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，大黃素組、合用低劑量組、高劑量組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與大黃素組相比，合用高劑量組大鼠LN、HA和HYP顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)（HE染色，×100）Fig.1 Histopathological of liver observed in different groups(HE,×100)

圖2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)（Masson染色，×100）Fig.2 Histopathological of liver observed in different groups(Masson,×100）

表1 各組大鼠血清ALT，AST和ALP活性比較（x±s）Tab.1 Comparison of ALT,AST and ALP activities in serum of hepatic fibrosis rats（x±s）

4 討論

肝纖維化是由慢性肝損傷引起的以細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為特征的常見(jiàn)多發(fā)病，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為早期肝纖維化經(jīng)過(guò)有效的治療是可逆的，通過(guò)抗纖維化治療可使肝纖維化進(jìn)程明顯減緩，程度明顯減輕，若不能有效治療，肝纖維化會(huì)最終發(fā)展為肝硬化甚至肝惡性腫瘤[7-9]。因此，進(jìn)行有效的抗肝纖維化是阻止肝臟疾病加重的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射CC14的經(jīng)典方法制備大鼠肝纖維化模型，CC14可直接溶解肝細(xì)胞膜，并在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)肝細(xì)胞細(xì)胞色素P450酶代謝轉(zhuǎn)化為活潑的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[10]。單劑量注射CC14可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，引起肝損傷，長(zhǎng)期重復(fù)給藥可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝惡性腫瘤[11]。當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)的ALT、AST、ALP等外漏入血，因此血清中ALT、AST、ALP水平可反映肝臟受損傷的程度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素組、合用中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和ALP水平顯著下降，合用高劑量組較大黃素組血清ALT、AST和ALP水平更低，表明大黃素可明顯改善大鼠肝功能，大黃素與丹參素合用可進(jìn)一步增加改善肝功能的效應(yīng)。

肝纖維化患者的細(xì)胞外基質(zhì)大量生成并沉積于肝臟，大量研究表明，血清中HA、LN、PCⅢ的含量與肝纖維化程度高度有關(guān)，是反映肝纖維化的靈敏指標(biāo)[13-17]。HA由激活的肝星狀細(xì)胞合成，在肝纖維化早期其他指標(biāo)尚未異常時(shí)就會(huì)升高，可反映肝纖維化的形成和纖維化程度。LN是基底膜主要多糖之一，由肝細(xì)胞和血竇內(nèi)皮細(xì)胞合成，當(dāng)肝纖維化發(fā)生時(shí)，LN明顯沉積并釋放入血，使血清中LN含量升高血清LN水平可反映肝纖維化的進(jìn)展與嚴(yán)重程度。PCⅢ被N-末端酶裂解后進(jìn)入血液中，隨著肝纖維合成的活躍而增多。肝臟中HYP的含量直接反映肝臟纖維化的程度[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后，大鼠血清中LN、HA、PCⅢ含量下降，肝勻漿中HYP含量明顯減少，合用高劑量組較大黃素組各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)一步改善，表明大黃素能夠抗肝纖維化，丹參素可增強(qiáng)大黃素抗肝纖維化的作用。

大黃素是瀉下類(lèi)中藥大黃的有效成分之一，具有抗炎抗氧化、保護(hù)肝腎、抗腫瘤等多種生物活性；丹參素是活血化瘀類(lèi)中藥丹參的活性成分之一，具有抗缺血、擴(kuò)張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗組織纖維化等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)考察了這兩種作用機(jī)制不同的有效成分聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠肝纖維化的影響，結(jié)果顯示兩者具有協(xié)同作用，其機(jī)制有待深入研究。

表2 大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量比較（x±s）Tab.2 Comparison of LN、HA、PCⅢin serum and HYP in liver of hepatic fibrosis rats（x±s）

[1] 朱亞平,卜淑蕊.肝纖維化發(fā)病機(jī)制研究新進(jìn)展[J].肝臟,2016,21(5):401-403.

[2] Bracht T,Schweinsberg V,Trippler M,et al.Analysis of diseaseassociated protein expression using quantitative proteomics-fibulin-5 is expressed in association with hepatic fibrosis[J].J Proteome Res,2015,14(5):2278-2286.

[3] 祝婷婷,劉 曉,汪小莉,等.大黃不同方法炮制后藥理作用及化學(xué)成分變化研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2016,25(8):883-887.

[4] 張建永,王 嵐,梁日欣,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹參山楂組分配伍抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)中藥雜志,2016,41(23):4408-4415.

[5] 張曉珣,王 俊,趙 宇,等.牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的治療作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2016,30(1):53-60.

[6] 景 晶,趙金英,華 冰,等.甘草總黃酮抑制硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1及Caspase-3的表達(dá)[J].中國(guó)中藥雜志,2015,40(15):3034-3040.

[7] 王靜濱,張 楊,李賀薇,等.柔肝丸治療乙型肝炎肝纖維化臨床研究[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(3):64-66.

[8] 王 靜,王緒霖.軟肝煎對(duì)高脂飲食肝纖維化大鼠HA、LV、PCⅢ、CⅢ及病理的影響[J].天津中醫(yī)藥,2017,34(2):128-131.

[9]李 欣,朱 英.肝纖維化發(fā)生相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志,2015,18(1):101-104.

[10]Doustimotlagh AH,Dehpour AR,Nourbakhsh M,et al.Alteration in membrane protein，antioxidant status and hexokinase activity in erythrocytes of CCl4-induced cirrhotic rats[J].Acta Med Iran,2014,52(11):795-803.

[11]閆冰川,丁常清,江偉熾,等.長(zhǎng)期腹腔注射四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的建立[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,32(6):1464-1465.

[12]董紅筠,王 敬,李 萍,等.軟肝化纖丸抗慢性乙型肝炎肝纖維化60例臨床觀察[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(5):266-268.

[13]張玲榮,郝彥琴,任姣龍,等.慢性乙肝患者肝纖維化與肝硬度、超聲量化指標(biāo)、血清肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(1):45-48.

[14]李 靜,楊雅娟,馮 艷,等.?；撬釋?duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠保護(hù)作用的研究[J].天津中醫(yī)藥,2017,34(5):336-340.

[15]任建琳,王 健,胡 曄,等.柴胡皂苷d對(duì)免疫性肝纖維化大鼠TGF-β1、HYP、SOD、MDA 的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(12):3044-3047.

[16]孟明輝.JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2011.

[17]鄭艷麗.IGF-1在大鼠肝纖維化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及扶正化瘀方對(duì)肝纖維化的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2011.

[18]曲蕃升,程 玉,彭金詠.膠原代謝在肝纖維化中的作用及中藥調(diào)控膠原代謝研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥師,2017,20(4):728-731.

[19]王曉萍,周語(yǔ)平.復(fù)肝寧對(duì)免疫性肝纖維化大鼠HYP SOD MDA的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,27(11):2492-2494.

[20]畢紅征,趙君玫,黃國(guó)鈞.HG顆粒對(duì)CCl_4復(fù)合因素所致肝纖維化大鼠血清HYP及TGFβ-1含量的影響[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,23(2):29-31.