劉 鵬 ，朱子昭 ，常 柏 ，李巧芬

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津 300050）

糖尿病在中國(guó)的患病率快速增長(zhǎng)，成年人患病率已達(dá)11.6%，更嚴(yán)重的是中國(guó)約有45%的糖尿病患者未被診斷[1]。糖尿病對(duì)患者生命及生活質(zhì)量最大的威脅來(lái)自其并發(fā)癥。長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致大血管及微血管動(dòng)脈粥樣硬化，伴有下肢血管病變的患者如果發(fā)生急、慢性損傷出現(xiàn)皮膚破潰，則會(huì)引發(fā)糖尿病足病，這是糖尿病患者住院率最高的疾病。糖尿病足的主要治療手段為清創(chuàng)、控制感染、改善局部血液循環(huán)，必要時(shí)需截肢[2]，糖尿病難愈性潰瘍的修復(fù)是困擾臨床醫(yī)生乃至整個(gè)內(nèi)分泌界的難題。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有生肌長(zhǎng)皮作用的外用藥多種多樣，生肌象皮膏是其中代表之一，目前多用于治療各種感染傷口、慢性潰瘍及糖尿病足[3]。本課題組既往的研究已經(jīng)證明，生肌象皮膏可以加速糖尿病大鼠難治性潰瘍創(chuàng)面的愈合；可以增加表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的含量；增加早期纖維連接蛋白的含量；能增加胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體的表達(dá)。生肌象皮膏可以在一定程度上抑制終末糖基化產(chǎn)物及受體的產(chǎn)生，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，更為明顯，促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合[4-7]，對(duì)治療糖尿病難治性潰瘍有著良好的臨床效果[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)酪氨酸激酶受體-2（Tie-2），血管緊張素Ⅰ（Ang-1）及血管緊張素Ⅱ（Ang-2）mRNA轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)觀察，進(jìn)一步揭示生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，28日齡，體質(zhì)量（102．83±4．10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 生肌象皮膏、凡士林、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇均購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室；鏈脲佐菌素（STZ），產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司；超純RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）試劑盒、5x RNA Loading Buffer，均產(chǎn)自TaKaRa公司。Real-Time PCR檢測(cè)目的基因引物，見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 羅氏血糖儀及試紙條，產(chǎn)自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；3K30型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司；Bio Tek Synergy2多功能酶標(biāo)儀，產(chǎn)自美國(guó)Bio-Te K公司；Bio-Rad電泳儀，產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad公司。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組 健康SD大鼠120只，均為雄性，在適應(yīng)性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量、血糖分層，隨機(jī)分為2組，分別為空白對(duì)照組20只，糖尿病組100只。糖尿病組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周，經(jīng)尾靜脈注射小劑量STZ的方法制備糖尿病模型，剔除糖尿病大鼠造模過程中死亡及未成模的大鼠。1周后經(jīng)過尾靜脈注射苯巴比妥麻醉，在背部后側(cè)用打孔器打直徑為2．5 cm的孔，深度傷及筋膜層，并及時(shí)止血及無(wú)菌紗布包扎，以制備潰瘍模型，剔除死亡及未成模大鼠。剩余隨機(jī)分為：生肌象皮膏組、凡士林組、糖尿病對(duì)照組3個(gè)糖尿病潰瘍模型組，每組各32只。

2.2 給藥 造模完成后用單籠飼養(yǎng)每組大鼠，自由飲水，常規(guī)飼料進(jìn)食。每日清晨祛除硬痂，常規(guī)消毒，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面后換藥布1次。生肌象皮膏組用生肌象皮膏紗條外敷，凡士林組用凡士林紗條外敷，空白對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組以生理鹽水紗條外敷。4組動(dòng)物創(chuàng)面均外用無(wú)菌紗布包扎，固定。

2.3 取材 剔除死亡及未成模大鼠，每組分別于造模成功后 1、3、7、14、21 d 處死部分大鼠，采用股動(dòng)脈取血及手術(shù)取新鮮創(chuàng)面肉芽組織，用液氮分別冷藏各時(shí)間點(diǎn)樣本，保存?zhèn)溆谩Ｔ炷３晒χ鲗?shí)驗(yàn)完成各組死亡大鼠數(shù)量分別為生肌象皮膏組10只，凡士林組9只，糖尿病對(duì)照組10只，故最終納入生肌象皮膏組22只，凡士林組23只，糖尿病對(duì)照組22只。

2.4 檢測(cè) 用SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法檢測(cè)各組潰瘍組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA，并進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)，核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，蛋白質(zhì)在280 nm附近有強(qiáng)吸收，利用此性質(zhì)使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的A260/A280的比值，理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在 1．9～2．1 范圍之間。取 5 μL RNA 用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用ABI 7500型熒光定量PCR儀，根據(jù)Real-Time PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照 2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式，即 F=2-{[待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值]-[對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組管家基因平均Ct值]}，計(jì)算出各樣本的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

于造模成功后 1、3、7、14、21 d 提取出的各組糖尿病大鼠潰瘍組織中Ang-1、Tie-2 mRNA水平均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0．05），且生肌象皮膏組大鼠潰瘍組織中Ang-1、Tie-2 mRNA水平明顯高于凡士林組及糖尿病對(duì)照組（P＜0．05），結(jié)果見表 2、3。各糖尿病模型組中Ang-2 mRNA水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0．05），且生肌象皮膏組 Ang-2 mRNA水平明顯低于糖尿病對(duì)照組（P＜0．05），結(jié)果見表4。

4 討論

外傷潰瘍屬于中醫(yī)中的瘡瘍，創(chuàng)面膿液的多少在一定程度上影響了潰瘍愈合的速度[9]，此為“偎膿長(zhǎng)肉”理論的概要。中醫(yī)治療的代表方為出自《瘍科綱要》的生肌象皮膏，其組成包括由象皮粉、當(dāng)歸、血余炭、龜板、生地、生爐甘石、生石膏、香油及白蠟。主藥為象皮，陳寶元等[10-12]對(duì)比含有及不含有象皮的兩種生肌膏在抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面的藥理作用，考察了象皮在組方中的作用和地位。其研究結(jié)果顯示，含有象皮的組方與無(wú)象皮的組方在臨床療效方面有明顯的差別，表明象皮在生肌象皮膏中有其獨(dú)特的作用和地位。孫玉芝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血余炭能較顯著增強(qiáng)血小板聚集作用，血余炭粗晶可進(jìn)促內(nèi)源性系統(tǒng)凝血，其止血原理與血漿中cAMP含量有關(guān)，并能降低血小板內(nèi)環(huán)核苷酸含量，有一定的抗炎、抗菌作用。爐甘石收濕止癢斂瘡，可吸收創(chuàng)面分泌物，周靈君等[14]研究發(fā)現(xiàn)爐甘石通過改善創(chuàng)面的血液循環(huán)、加速創(chuàng)面的新陳代謝、促進(jìn)傷口成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的形成，加快肉芽組織增生等方面的作用，加速皮膚創(chuàng)口的愈合。煅石膏收濕止血、生肌斂瘡，李祥等[15]對(duì)照煅石膏與生石膏的生肌藥效發(fā)現(xiàn)，煅石膏治療組與生石膏治療組比較，大鼠創(chuàng)口成纖維細(xì)胞數(shù)、肉芽組織中毛細(xì)血管數(shù)和肉芽組織中毛細(xì)血管面積均顯著增加，表明煅石膏能夠促進(jìn)大鼠傷口成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的形成，加快肉芽組織增生，從而加速皮膚創(chuàng)口的愈合。再配伍當(dāng)歸、生地、龜板三藥濡養(yǎng)受損皮膚，養(yǎng)血生津，生肌長(zhǎng)皮。

表2 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Ang-1 mRNA水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the level of Ang-1 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s)μg/L

表3 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Ang-2 mRNA水平比較（x±s）Tab.3 Comparison of the level of Ang-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group（x±s） μg/L

表4 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Tie-2 mRNA水平比較（x±s）Tab.4 Comparison of the level of Tie-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group（x±s） μg/L

在高糖條件下，炎癥反應(yīng)低下且呈階段性延長(zhǎng)、新生血管生長(zhǎng)緩慢、基質(zhì)蛋白水解酶呈高水平狀態(tài)、膠原合成減少、肉芽組織形成變慢等[16-17]。新生血管網(wǎng)的形成是創(chuàng)面修復(fù)的中心環(huán)節(jié)[18]，只有形成豐富的新生血管網(wǎng)，才能為組織修復(fù)提供所必須的氧及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)創(chuàng)面微循環(huán)，加速創(chuàng)面愈合。

本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與既往研究觀點(diǎn)相一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示糖尿病皮膚潰瘍愈合困難可能與創(chuàng)面局部Ang-2表達(dá)水平持續(xù)升高及Ang-1、Tie-2表達(dá)水平下降有關(guān)。生肌象皮膏可抑制糖尿病創(chuàng)面肉芽組織中Ang-2的表達(dá)，可能通過上調(diào)創(chuàng)面肉芽組織中Ang-1、Tie-2的表達(dá)水平，下調(diào)Ang-2的表達(dá)水平促進(jìn)糖尿病潰瘍面的愈合。Ang/Tie-2信號(hào)通路與血管生成密切相關(guān)，其中Ang-1能夠促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞存活并維定狀態(tài)。同時(shí)，Ang-2通過介導(dǎo)血管去穩(wěn)態(tài)化，拮抗Ang-1的作用靶點(diǎn)，從而抑制血管生成、成熟與存活[19]。升高的Ang-2一方面導(dǎo)致炎癥過程延長(zhǎng)，另一方面拮抗Ang-1的作用，導(dǎo)致新生毛細(xì)血管成熟障礙、滲透性增加、創(chuàng)面愈合慢。

酪氨酸蛋白激酶受體－2（Tie－2）作為 Ang-1 和Ang-2的共同受體，Ang-1與其結(jié)合后，能夠促進(jìn)血管重塑以及新生血管的成熟，并進(jìn)一步維持血管內(nèi)皮的完整性[20]。另外，Ang-1/Tie-2還能夠通過阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子缺乏而發(fā)生的凋亡。在內(nèi)皮細(xì)胞中，Ang-2可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Ang-1引起的Tie-2磷酸化，抑制血管周圍細(xì)胞的積聚，并拮抗Ang-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生肌象皮膏組Tie-2表達(dá)水平升高，提示生肌象皮膏可能通過促進(jìn)Tie-2的表達(dá)、增加Ang-1的受體數(shù)量，進(jìn)而增加創(chuàng)面肉芽組織中新生毛細(xì)血管的建立、成熟及穩(wěn)定，以此保證肉芽組織的血供，促進(jìn)潰瘍面的愈合。

本實(shí)驗(yàn)以糖尿病潰瘍動(dòng)物模型為載體，從Ang/Tie-2通路表達(dá)促進(jìn)血管新生角度探討生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的可能作用機(jī)制，同時(shí)也為中醫(yī)“偎膿長(zhǎng)肉”理論提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 陸菊明.中國(guó)2型糖尿病防治指南（2013年版）更新要點(diǎn)的解讀[J].中國(guó)糖尿病雜志，2014,22(10):865.

[2] Helary C,Zarka M,Giraud-Guille MM.Fibroblasts within concentratedcollagenhydrogelsfavourchronicskinwoundhealing[J].J Tissue Eng Regen Med,2012,6(3):225-237.

[3] 關(guān) 靖,陳寶元,李京向.生肌象皮膏研究現(xiàn)狀[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,34(1):122-123.

[4] 李巧芬,常 柏.生肌象皮膏對(duì)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織的終末糖基化產(chǎn)物及受體的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001,20(1):26-28.

[5] 李巧芬,常 柏.生肌象皮膏對(duì)糖尿病大鼠難治性潰瘍愈合速度的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2008,46(5):96-97.

[6] 李巧芬,常 柏.糖尿病大鼠難治性潰瘍模型的復(fù)制及病理學(xué)觀察[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2002,22(2):72-74.

[7] 李巧芬,常 柏.生肌象皮膏對(duì)2型糖尿病大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及受體的影響[J].天津中醫(yī)藥,2012,29(6):570-573.

[8] 常 柏，李巧芬，李曉軍．生肌象皮膏治療糖尿病難治性潰瘍64例[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2006，33(10)：1299-1299．

[9] 蘇安平.淺談中醫(yī)外治對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的作用[J].甘肅中醫(yī),2006,4(19)：1-2.

[10]李京向,陳寶元,閻伯君,等.生肌象皮膏中象皮作用與地位的臨床研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(9):1835-1838.

[11]劉 芳,陳寶元.牛皮方生肌膏與象皮方生肌膏病理對(duì)比研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(12):2506-2507,2541.

[12]杜韋靜,陳寶元,薛曉東,等.生肌象皮膏與無(wú)象皮處方生肌膏的體外抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(7):1290-1294.

[13]孫玉芝,張朝暉,馬 靜.血余炭在缺血性疾病傷口中的研究探討[A].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì).中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)周圍血管病分會(huì)第六屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C].北京:中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì),2014:3.

[14]周靈君,張 麗,丁安偉.爐甘石斂口生肌的藥效學(xué)研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(4):333-337.

[15]李 祥,劉元芬,項(xiàng)曉人,等.石膏炮制前后的生肌藥效比較研究[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2006,4(6):624-627.

[16]Lee YH,Chang JJ,Chien CT,et al.Antioxidant sol-gel improves cutaneous wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Exp Diabetes Res,2012:1-11.

[17]K?mpfer H,Pfeilschifter J,Frank S.Expressional regulation of angiopoietin-1 and-2 and the tie-1 and-2 receptor tyrosine kinases during cutaneous wound healing:a comparative study of normal and impaired repair[J].Lab Invest,2001,81(3):361-373.

[18]Fagiani E,Christofori G.Angiopoietins in angiogenesis[J].Cancer Lett,2013,328(1):18-26.

[19]閆 鍇.血管生成素-2(Angiopoietin-2)調(diào)節(jié)小鼠下肢缺血血管生成的研究[D].成都：四川醫(yī)科大學(xué),2015.

[20]曾績(jī)娟,楊博華,李麗娜,等.下肢缺血大鼠模型肌組織中Tie-2和VEGF蛋白表達(dá)初步研究[J].疑難病雜志,2009,8(3):135-137.