孫甫+楊姣+吳文煥+王磊+田宇

摘 要：轉(zhuǎn)基因動物是應(yīng)用實驗的方法將外源基因?qū)氲皆缙诘呐咛?nèi)，使之可以在動物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定的整合，并能遺傳給后代的一類動物。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物模型逐漸應(yīng)用在醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域。本文對轉(zhuǎn)基因動物模型的幾種常用建模方法做一綜述，探討各種不同的轉(zhuǎn)基因動物模型制作方法的優(yōu)劣。最后以顯微注射法為例簡述制作轉(zhuǎn)基因動物的方法。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；動物模型；顯微注射法

中圖分類號：R-332 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.01.014

文章編號：1006-1959（2018）01-0035-03

Development of Transgenic Animal Models

SUN Fu1，YANG Jiao2，WU Wen-huan2，WANG Lei1，TIAN Yu1

（1.First Affiliated Hospital of Xi'an Medical College，Xi'an 710077，Shaanxi，China；

2.Xi'an Medical College，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：Transgenic animals are the experimental methods used to introduce exogenous genes into early embryos so that they can be stably integrated in the genome of animal genomes and can be passed on to offspring animals.With the development of transgenic technology and molecular genetics， transgenic animal models are gradually applied in various fields of medical science.This article reviews several commonly used modeling methods for transgenic animal models and discusses the advantages and disadvantages of various methods for making transgenic animal models. Finally，the microinjection method as an example to describe the method of making transgenic animals.

Key words：Transgene；Animal model；Microinjection

轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animals）是指應(yīng)用實驗的方法將外源基因?qū)氲皆缙诘呐咛?nèi)，使之可以在動物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定的整合，并能遺傳給后代的一類動物。轉(zhuǎn)基因動物所有的細(xì)胞均整合有外源基因，并具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物，這類動物只有在整合了外源基因的“局部組織細(xì)胞”恰為生殖細(xì)胞時，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。隨著遺傳操作技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制、基因功能、藥物篩選、治療效果評價等多個方面的研究[1]。1980年Gordon等向單核胚胎的原核內(nèi)注射純化的DNA從而制成了第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。2年后Palmiter等將重組的大鼠生長激素基因注入小鼠的受精卵原核，從而制成了生長速度明顯增快的超級鼠[2]。1987年Capecdhi等根據(jù)同源重組的原理，實現(xiàn)了導(dǎo)入的外源基因的定點整合，亦稱之為基因打靶技術(shù)[3]。從此轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸成熟并應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。雖然目前轉(zhuǎn)基因動物模型的制作方法多種多樣，但是在實驗室應(yīng)用中仍存在較多問題，各種不同的轉(zhuǎn)基因動物模型制作方法各存在其自身的優(yōu)缺點。本文對目前實驗室應(yīng)用較多的幾種轉(zhuǎn)基因動物模型制作方法逐一回顧，分析其中的優(yōu)缺點，希望能夠找到一種目前應(yīng)用最廣泛的制作轉(zhuǎn)基因動物模型的方法[4]。目前實驗室制作轉(zhuǎn)基因動物模型的方法根據(jù)外源基因?qū)氲姆椒ê蛯ο蟮牟煌梢苑譃橐韵聨追N：分別為顯微注射法、精子載體導(dǎo)入法、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）法、反轉(zhuǎn)錄病毒法、電脈沖法、等[5]，我們將在本文逐一介紹。

1顯微注射法

顯微注射法是目前最常用并且是實驗室應(yīng)用最成熟的專基因動物模型制作方法，其大致的過程如下：首先，選取6～8 w齡的雌性小鼠，向其腹腔內(nèi)注射血清促性腺激素（pregnant mare serum gonactotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（humar chorionic gonactotropin，HCG），促進(jìn)排卵。然后將其與雄性小鼠1：1交配。交配成功的標(biāo)志是在雌性小鼠的陰道口發(fā)現(xiàn)白色的陰道栓。次日上午，將確認(rèn)有陰道栓的雌性小鼠用頸椎脫臼法剖殺，取出輸卵管，仔細(xì)沖洗后小心取出受精卵。受精卵中有兩個原核，分別來自精子和卵子，向雄性原核中注入DNA溶液。用結(jié)扎了輸精管的雄性小鼠與發(fā)情期的雌性小鼠交配，刺激雌性小鼠的子宮頸管，造成假孕雌性小鼠。將受精卵移植至交配第3 d的假孕鼠輸卵管中，使之正常發(fā)育，操作時注意，因為DNA注入可能造成損傷，因此許多受精卵在中途停止發(fā)育，因此建議在注射時采用雙側(cè)多受精卵移植的方法。在注射成功后，應(yīng)用PCR法對導(dǎo)入的遺傳基因進(jìn)行分析，挑選出外源性基因?qū)氤晒Φ男∈筮M(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖[6]。endprint

顯微注射DNA的方法目前應(yīng)用較多，是實驗室真正成熟并可以穩(wěn)定生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的有效方法。但在其制作過程中仍涉及復(fù)雜的操作過程[7]。首先，在制作過程中要注意掌握母畜的性周期，使母畜在預(yù)先設(shè)定的時間內(nèi)排卵，以保證獲得大量剛剛受精的單細(xì)胞胚胎。其次，此種方法制作的轉(zhuǎn)基因動物只能約占子代中的1%～3%，效率較低，但是結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，并且成本較低，是目前實驗室常用的一種值得推薦的方法[8]。

2精子導(dǎo)入法

利用雄性精子作為外源性基因，借助受精作用把外源基因?qū)胧芫?，整合到受精卵的基因組中的方法稱為精子導(dǎo)入法，是制作轉(zhuǎn)基因動物的一種新的方法。此方法把精子作適當(dāng)處理后，使其具有攜帶外源基因的能力，然后用攜帶有外源基因的精子給母畜受精，在母畜的后代中就會產(chǎn)生一定比例的動物是整合了外源基因的動物。該法簡單、方便。與顯微注射法，其成本較低，同時不涉及對動物進(jìn)行手術(shù)處理，因此其操作相對簡單[9-10]。但在實踐過程中仍然發(fā)現(xiàn)這種方法成功率較低，而且對于精子是否可作為外源DNA載體也存在爭論。因此目前這項技術(shù)仍處在早期探索階段，仍需進(jìn)一步實驗室研究。應(yīng)用此種方法可以將人工授精、體外受精與轉(zhuǎn)基因結(jié)合起來。

3胚胎干細(xì)胞法

胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是指從囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的尚未分化的胚胎細(xì)胞，將其進(jìn)行體外培養(yǎng)，擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化和制作遺傳突變型等遺傳操作。本法以整合有外源基因的ES細(xì)胞作為供體細(xì)胞，將注射過的胚胎經(jīng)培養(yǎng)后篩選無發(fā)育缺陷的囊胚，移植到交配第3 d的假孕受體動物子宮內(nèi)，培育出轉(zhuǎn)基因動物。這種辦法外源基因整合率較高，但是不易建立ES細(xì)胞系。并且在實驗過程中要通過嵌合體途徑，因此實驗周期比較長[11-12]。胚胎干細(xì)胞法外源基因的整合率較高，實驗者可以在植入囊胚前選擇合適轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞，避免了以前只能在子代篩選的缺點，并能充分利用分子生物學(xué)發(fā)展起來的各種先進(jìn)方法，是一種目前實驗室很有前途的技術(shù)。但是它同樣存在缺點，比如不易建立ES細(xì)胞系。并且由于通過嵌合體途徑，所以實驗周期長。但是，仍是目前實驗室較有前景的一種轉(zhuǎn)基因動物模型制作方法。

4反轉(zhuǎn)錄病毒法

反轉(zhuǎn)錄病毒具有侵入宿主細(xì)胞并整合于細(xì)胞的染色體DNA的能力。將外源基因DNA插入反轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過輔助細(xì)胞包裝成高感染度的病毒顆粒，感染胚胎后，將感染的桑椹期胚胎細(xì)胞導(dǎo)入子宮，可發(fā)育成攜帶外源基因的子代動物[13]。

該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點整合，適合于難以觀察到原核的禽類受精卵。由于病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10 kb，否則影響活性和穩(wěn)定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達(dá)[14]。

5電脈沖法

電脈沖法（electroporation）又稱電穿孔法，是將供體DNA與受體細(xì)胞充分混勻，在外界的高電壓短脈沖下改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬間可逆性電穿孔，從而使一定大小的DNA可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，運(yùn)送到細(xì)胞核。目前在動物中電脈沖法主要用來轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞[15]。

以上方法是目前實驗室制作轉(zhuǎn)基因動物模型常用的幾種方法，各自有其優(yōu)缺點，適用于不同的轉(zhuǎn)基因模型制作過程。我們以顯微注射法為例，簡述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的制作過程。用顯微注射法制作的第一代子鼠為嵌合體子鼠，因此并非子鼠全部細(xì)胞中均有導(dǎo)入的外源基因，為了得到純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠，還需用產(chǎn)生的雄性小鼠與提供囊胚的雌性小鼠交配，也稱作回交[16]?；亟缓螽a(chǎn)生的子代小鼠有兩種，野生型與雜合體。將雜合體小鼠互交后產(chǎn)生的子代鼠中會有野生型，雜合體和純合體三種，通過PCR的方法可以將純合體挑選出來，再進(jìn)行繁殖，這樣就能夠得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠品系[17-18]。

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是上世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種高新生物技術(shù)，近年來得到了飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物在生命科學(xué)研究中的重要性也越來越受到人們的重視。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的核心，是把遺傳的功能單位─基因轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，使它成為動物體內(nèi)的一部分。被轉(zhuǎn)移的基因可以來自同種或異種動物，也可以來自植物或微生物[19]。這樣一來，就打破了物種之間的界線，也可以說動物能與植物、微生物雜交了。目前，轉(zhuǎn)基因動物模型大部分局限于單個基因的轉(zhuǎn)移，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們預(yù)料未來會出現(xiàn)多個基因的同時轉(zhuǎn)移，那么轉(zhuǎn)基因動物模型的應(yīng)用范圍又將極大擴(kuò)展。在轉(zhuǎn)基因動物方面，我國也取得了許多優(yōu)秀的成果，目前已獲得了轉(zhuǎn)基因魚、兔、雞等多種轉(zhuǎn)基因動物[20-21]。雖然目前圍繞轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用仍然存在一些爭論，但是我們認(rèn)為隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)必將擁有更為廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉紅林.轉(zhuǎn)基因動物制備技術(shù)[J].中國豬業(yè)，2016，11（4）：60-61.

[2]張赟，周國麗，楊冉，等.高G-C含量突變型Foxo1轉(zhuǎn)基因動物基因型鑒定PCR方法的建立[J].河南科學(xué)，2017，35（2）：204-208.

[3]Jolivet G，Braud S，Dasilva B，et al.Induction of body weight loss through RNAi-knockdown of APOBEC1 gene expression in transgenic rabbits.[J].Plos One，2014，9（9）：e106655.

[4]陳宇浩，馬達(dá)靈，賀番，等.病毒載體及其在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用[J].探索科學(xué)，2016（9）：379.

[5]余科科，汪思應(yīng).轉(zhuǎn)基因小鼠在生命科學(xué)中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（1）：23-24.

[6]董賢慧，高維娟，賀小平，等.淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠大腦皮質(zhì)DM T1表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（16）：2176-2179.endprint

[7]張春麗，李忠海，周穎，等.構(gòu)建骨質(zhì)疏松動物模型建模方法的改進(jìn)及評價[J].中國組織工程研究，2016， 20（5）：754-759.

[8]Wang Q，Qian L，Jiang S，et al.Safety Evaluation of Neo Transgenic Pigs by Studying Changes in Gut Microbiota Using High-Throughput Sequencing Technology[J].Plos One，2016，11（3）：e0150937.

[9]黃愛良，黃榮志，黃小倩，等.動脈粥樣硬化動物模型構(gòu)建的方法與現(xiàn)狀[J].中國組織工程研究，2015（27）：4423-4428.

[10]Sarkar T，Thankappan R，Kumar A，et al.Stress Inducible Expression of AtDREB1A Transcription Factor in Transgenic Peanut（Arachis hypogaea L.）Conferred Tolerance to Soil-Moisture Deficit Stress[J].Frontiers in Plant Science，2016，7（935）.

[11]Maksimenko OG，Deykin AV，Khodarovich YM，et al.Use of Transgenic Animals in Biotechnology：Prospects and Problems[J].Acta Naturae，2013，5（1）：33-46.

[12]Deepanker Y，Israr A，Pawan S，et al.Overexpression ofArabidopsis Ann At 8 Alleviates Abiotic Stress in Transgenic Arabidopsisand Tobacco[J].Plants，2016，5（2）：18.

[13]Okamoto K W，F(xiàn)red G，Lloyd A L.Integrating Transgenic Vector Manipulation with Clinical Interventions to Manage Vector-Borne Diseases[J].Plos Computational Biology，2016，12（3）：e1004695.

[14]Park JE，Xian FZ，Choi SH，et al.Generation of transgenic marmosets expressing genetically encoded calcium indicators[J].Scientific Reports，2016，6：34931.

[15]Eissa HF，Hassanien SE，Ramadan AM，et al.Developing transgenic wheat to encounter rusts and powdery mildew by overexpressing barleychi 26 gene for fungal resistance[J].Plant Methods，2017，13（1）：41.

[16]李樂，繆衛(wèi)國，劉文波，等. 全長和缺失信號肽類似序列的HpaXm轉(zhuǎn)基因煙草及其抗病性比較[EB/OL].北京：中國科技論文在線 [2015-01-20].http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201501-327.

[17]李國玲，鐘翠麗，莫健新，等.動物基因組定點整合轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展[J].遺傳，2017，39（2）：98-109.

[18]Nageswara-Rao M，Hanson M，Agarwal S，et al.Genetic diversity analysis of switchgrass（Panicum virgatum，L.）populations using microsatellites and chloroplast sequences[J].Agroforestry Systems，2014，88（5）：823-834.

[19]Ogo Y，Wakasa Y，Hirano K，et al.Generation of transgenic rice with reduced content of major and novel high molecular weight allergens[J].Rice，2014，7（1）：1-9.

[20]Wang H，Wu H，Wang K，et al.Expression of recombinant human lysozyme in transgenic chicken promotes the growth of Bifidobacterium，in the intestine and improves postnatal growth of chicken[J].Amb Express，2016，6（1）：110.

[21]Zhang J，Yu H，Zhang Y，et al.Increased abscisic acid levels in transgenic maize overexpressing AtLOS5 mediated root ion fluxes and leaf water status under salt stress[J].Journal of Experimental Botany，2016，67（5）：1339.

收稿日期：2017-7-21；修回日期：2017-8-20

編輯/李樺endprint