吳樹坤，劉梅，鄧杰，衛(wèi)春會，黃治國

(四川理工學(xué)院，釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢，643000)

窖池作為中國白酒的發(fā)酵場所，窖泥的品質(zhì)尤為重要，直接關(guān)乎著白酒的質(zhì)量。窖泥中微生物對酒質(zhì)的影響是通過多種酶促反應(yīng)實現(xiàn)的，分析窖泥酶活性是鑒定窖泥質(zhì)量的一個重要方面[1]。窖泥微生物群落經(jīng)長期的富集與馴化并改善著窖泥的品質(zhì)，由于用理化指標(biāo)來反映窖泥的品質(zhì)具有一定的局限性，而窖泥中的酶是由窖泥微生物代謝釋放于窖泥中，因此用窖泥的酶活指標(biāo)反映窖泥菌群結(jié)構(gòu)從而表征窖泥質(zhì)量能很好地彌補前者的不足。但目前對窖泥中酶的相關(guān)報道還較少，且單個樣品研究的酶種類少。土壤是制作窖泥的主要原料，因此窖泥中酶的研究主要參考土壤學(xué)中酶的研究方法。本項目以不同品質(zhì)的濃香型窖泥為樣品，應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究窖泥中微生物群落的多樣性，并分析測定了5種對白酒釀造具有重要作用酶系的活力，再利用SPSS軟件和Mothur軟件將不同品質(zhì)窖泥的微生物多樣性與窖泥酶活進行相關(guān)性分析以得到其規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

窖泥樣品，四川地區(qū)某濃香型白酒廠生產(chǎn)窖池，且窖池連續(xù)生產(chǎn)使用在5年以上，根據(jù)酒廠常年的生產(chǎn)情況，將全廠窖池分為一等、二等、三等3個質(zhì)量等級進行取樣。取樣部位為每口窖池窖底中心部位，相同品質(zhì)的窖泥樣品取3個平行樣，并按照窖泥等級由高到低的順序依次進行1～9編號。取回的窖泥樣品分成兩部分保藏，一部分用于測定酶活，4 ℃冷藏；另一部分用于提取DNA，-20 ℃冷凍保存。

1.1.2 主要試劑

苯酚、甲醇、次氯酸鈉、尿素、硫酸銨、甘氨酸、茚三酮、酪素、無水乙醇、磷酸苯二鈉(分析純，成都科龍化工)，氯代二溴對苯醌亞胺(分析純，貝斯特試劑)，甲苯、高錳酸鉀、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷、連二亞硫酸鈉(分析純，中國醫(yī)藥集團)，亞硫酸鈉、氯化三苯基四氮唑、甲醛(分析純，重慶川東化工集團)。DNA提取純化試劑：PowerSoil DNA Isolation Kit(MOBIO，美國)，Gel Extraction Kit(康為世紀(jì)，中國)，Quant-iT PicoGreen DNA Kit(Invitrogen，美國)；PCR試劑：buffer、MgCl2、EXTaq酶、dNTPs、DNA Marker(Takara，日本)，正反向引物(上海生工，中國)；高通量測序試劑由美國Roche公司提供。

1.1.3 主要儀器

高速低溫離心機(Thermo，美國)，酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，高速離心機(Eppendorf，德國)，電泳儀(Bio-rad，美國)，均質(zhì)機(SCILOGEX，美國)，熒光分光光度計(Promaga，美國)，高通量測序儀(Roche，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥酶活測定方法

采用靛酚比色法測定脲酶活性[2]；采用茚三酮比色法測定酸性蛋白酶活性[3]；采用磷酸苯二鈉比色法測定窖泥中酸性磷酸酶活性[4]；采用高錳酸鉀滴定法測定窖泥中過氧化氫酶活性；采用TTC(氯化三苯基四氮唑)法測定窖泥中脫氫酶酶活[5]。

1.2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)檢測方法

1.2.2.1 窖泥總DNA的提取

窖泥中的腐殖酸是干擾DNA提取及后續(xù)PCR擴增反應(yīng)的主要因素，因此采用MOBIO公司PowerSoil DNA Isolation Kit提取窖泥微生物總DNA，提取后的DNA樣品取5 μL于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。DNA樣品于-20 ℃保存。

1.2.2.2 窖泥DNA PCR擴增

選用通用引物968F-1401R。PCR反應(yīng)體系為25 μL，體系包括：2.5 μL 10×Buffer，2 μL 25 mmol/L dNTP，2 μL MgCl2，正反向引物10 μmol/L各0.5μL，0.5 μL 5 U/μL的EXTaq酶，DNA模板用量為0.3 μL(原液DNA稀釋 20倍)，最后用雙蒸水補充至25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；30個循環(huán)：94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；72 ℃ 10 min。對擴增后DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測有無PCR產(chǎn)物。

1.2.2.3 PCR擴增產(chǎn)物純化及定量

采用康為世紀(jì)Gel Extraction Kit對PCR擴增目的產(chǎn)物進行回收純化以除去引物二聚體，回收后取5 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)純化后的產(chǎn)物濃度是否滿足測序要求，測序前需采用Quant-iT PicoGreen Kit對純化后對PCR產(chǎn)物進行定量。

1.2.2.4 高通量測序

由于涉及對微生物群落定量分析，因此測序前需對DNA樣品進行均一化；微乳滴PCR使DNA在獨立反應(yīng)空間進行擴增，以降低外界條件的干擾。emPCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 4.5 min，68 ℃ 30 s，反應(yīng)循環(huán)50次；10 ℃保溫；將emPCR擴增產(chǎn)物從微乳滴中分離出來，將準(zhǔn)備好的PicoTiterPlate反應(yīng)板裝入高通量測序儀進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

酶活指標(biāo)的測定結(jié)果用x±Sd表示。高通量測序數(shù)據(jù)分析：利用Mothur軟件對測序數(shù)據(jù)進行總體分析后，再用測序序列與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得OTU(Operational Taxonomic Units)分類，確定序列對應(yīng)微生物的分類學(xué)地位。利用SPSS 20軟件對窖泥酶活數(shù)據(jù)進行方差分析，并將其和微生物群落結(jié)構(gòu)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 窖泥酶活測定結(jié)果與分析

本試驗研究了脲酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、脫氫酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同品質(zhì)的窖泥各酶活指標(biāo)呈現(xiàn)不同趨勢和差異。如圖1所示，不同等級窖泥的脲酶活性差異顯著(p<0.05)，隨窖泥品質(zhì)的提升而呈現(xiàn)出降低的趨勢。一級窖泥的脲酶平均活性分別比二級和三級窖泥低50.0%和77.0%，這表明品質(zhì)越好的窖泥，尿素越不易被催化分解，而尿素作為有機氮源可能有利于某些窖泥微生物的生長代謝。蛋白酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶的酶活隨窖泥品質(zhì)的提升而升高。

圖1 脲酶測定結(jié)果Fig.1 Result of urease determination 注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)圖2～圖5與此相同。

如圖2所示，一級品質(zhì)窖泥中蛋白酶酶活顯著高于另外兩個等級的窖泥，其中一級窖泥蛋白酶酶活比二級窖泥高61.8%，二級窖泥蛋白酶活性比三級窖泥高70%。品質(zhì)越好的窖泥蛋白酶酶活越高，可能意味著窖泥微生物能有更多的由蛋白質(zhì)分解帶來的營養(yǎng)物質(zhì)。

圖2 蛋白酶測定結(jié)果Fig.2 Result of protease determination

如圖3所示，一、二級窖泥中的酸性磷酸酶酶活顯著(p<0.05)高于三級窖泥。一級窖泥酸性磷酸酶酶活分別比二級窖泥、三級窖泥高35.5%和250.0%。

圖3 酸性磷酸酶測定結(jié)果Fig.3 Result of acid phosphatase determination

如圖4所示，一級窖泥過氧化氫酶酶活分別比二級窖泥、三級窖泥高93.8%和689.3%，過氧化氫酶酶活隨窖泥品質(zhì)的升高而呈現(xiàn)出上升趨勢。有研究表明[6]，過氧化氫酶的活性與pH密切相關(guān)，pH值越接近中性，過氧化氫酶活性越高，而一級窖泥的過氧化氫酶酶活高是否是由于窖泥pH更接近中性，需進一步驗證。

圖4 過氧化氫酶測定結(jié)果Fig.4 Result of catalase determination

如圖5所示，一級窖泥中脫氫酶活與二、三級窖泥差異顯著(p<0.05)，且酶活明顯低于其他兩種品質(zhì)的窖泥，表明其氧化還原反應(yīng)的強度明顯較弱。一級窖泥脫氫酶酶活分別比二、三級窖泥低80.5%和80.9%。白酒發(fā)酵的過程，特別是產(chǎn)香階段，是一個緩慢的過程，而王秀菊[7]認(rèn)為脫氫酶活性高低與有機質(zhì)降解速率呈正相關(guān)，表明優(yōu)質(zhì)窖泥脫氫酶活性上的特點較一般窖泥而言可能更有利于香氣成分的生成。

圖5 脫氫酶測定結(jié)果Fig.5 Result of dehydrogenase determination

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果

2.2.1 窖泥總DNA提取及PCR擴增結(jié)果

MIBIO公司的PowerSoil DNA Isolation Kit能有效除去窖泥中的腐殖酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，獲得純度較高的DNA。所得窖泥總DNA均采用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖6所示。使用2%的瓊脂糖凝膠獲取PCR擴增產(chǎn)物，以便后續(xù)純化。PCR擴增結(jié)果如圖7所示。純化后的DNA使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖8所示。

圖6 窖泥總DNA電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of total DNA samples

圖7 窖泥DNA PCR擴增電泳圖Fig.7 Electrophoretogram of PCR products

圖8 純化后PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.8 Electrophoretogram of purified PCR products

2.2.2 窖泥微生物群落多樣性分析

2.2.2.1 窖泥樣品中細(xì)菌OTU分類

通過Mothur軟件對測序數(shù)據(jù)處理，在基于3%的非相似度條件下，一共分成了2 050個可操作分類單元(OTU)分類。8號樣品的測序序列數(shù)在2 000條左右。5號樣品的測序序列最多，超過了5 200條。窖泥樣品的OTU數(shù)量方面，一級窖泥樣品1、2、3號OTU數(shù)分別是249、297、492個；二級窖泥樣品4、5、6號OTU數(shù)分別是195、61、305個；三級窖泥樣品7、8、9號OTU數(shù)分別是178、63、210個。其中一級窖泥獲得的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的50.6%，其中二級窖泥的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的27.4%，三級窖泥的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的22.0%。不難發(fā)現(xiàn)，窖泥中細(xì)菌OTU數(shù)隨著窖泥品質(zhì)的提升而呈現(xiàn)出上升趨勢。

2.2.2.2 窖泥中細(xì)菌門的分類

將窖泥樣品的OTU用Mothur軟件進一步分析處理，獲得微生物不同的門分類。如圖9所示，在9個窖泥樣品中一共劃分出了9個門，分別是Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Chlorflexi(綠彎菌門)、Synergistetes(互養(yǎng)菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Tenericutes(無壁菌門)、Spirochaetes(螺旋體門)、Lebtisphaeria。這幾個門中既有厭氧菌，又有好氧菌，也有兼性厭氧菌，說明白酒發(fā)酵并不是處在一個單一的嚴(yán)格厭氧環(huán)境中。

圖9 不同品質(zhì)窖泥微生物群落門分類Fig.9 Phylum of microbial community in pit mud of different qualities

在所有對比出的細(xì)菌序列中(除去unclassified)可以發(fā)現(xiàn)，每個窖泥樣品細(xì)菌群落中，占主導(dǎo)地位的都是Firmicutes(厚壁菌門)，這類菌具有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，并且大多數(shù)能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子抵抗極端環(huán)境。其中一級窖泥樣品(1、2、3號)厚壁菌門占50%～55%，二級窖泥樣品(4、6號)厚壁菌門占41%～43%，三級窖泥樣品(7、9號)厚壁菌門占21%～31%。可見，隨著窖泥品質(zhì)的提升，厚壁菌門所占比例也有所增大。而擬桿菌門、無壁菌門和螺旋體門所占比例隨著窖泥品質(zhì)的提升有一定程度減少。綠彎菌門是一類通過光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌，是兼性厭氧微生物。在一級窖泥中未發(fā)現(xiàn)有綠彎菌門的存在，而在二、三級窖泥中綠彎菌門約占2%～3%。互養(yǎng)菌門有降解氨基酸能力，部分為專性厭氧，且能耐60 ℃的高溫[8]。互養(yǎng)菌門在一級窖泥中所占比例為4%～6%，比二、三級窖泥高許多，這與優(yōu)質(zhì)窖泥能促進提高酒質(zhì)是相對應(yīng)的。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，大多數(shù)具有固氮能力，兼性或?qū)Ｐ詤捬?，也包括很多病原菌。其在品質(zhì)較低的窖泥中變形菌門所占比例較高。放線菌門大多數(shù)為好氧，在不同品質(zhì)窖泥中所占比例差異較大，尤其在一級窖泥中的比例頗高。Lebtisphaeria在不同品質(zhì)窖泥中所占比例比較一致，都在1%左右。

2.2.2.3 窖泥中細(xì)菌屬的分類

在獲得窖泥中細(xì)菌門的分類基礎(chǔ)上，進一步對窖泥中細(xì)菌進行屬的分類。如圖10所示，9個窖泥樣品中一共獲得39個屬。利用SPSS軟件對窖泥樣品的菌屬進行主成分分析，提取出對窖泥品質(zhì)劃分有較大影響的菌屬，對其隨窖泥品質(zhì)的變化情況進行研究分析。

圖10 不同品質(zhì)窖泥微生物群落屬分類Fig.10 Genus of microbial community in pit mud of different qualities

選取特征值大于5的成分，如表1所示，成分1、成分2、成分3、成分4特征值分別為10.414、10.094、7.634、5.446，累積貢獻達到83.97%，說明成分劃分合理。如圖11所示，散點圖中窖泥樣品1、2、3號，4、6號，7、9號分別聚為一組，基本按窖泥品質(zhì)一級、二級、三級劃分，5、8號窖泥樣品聚為一組原因是測序序列都較少，微生物覆蓋率較低的緣故。因此按照成分1和成分2對窖泥中細(xì)菌的屬進行分析。成分1中，載荷值較高的細(xì)菌屬為Sporobacter、Coriobacterineae、Clostridium、Cellulomonadaceae、Sedimenlibacter、Aminobacterium、Corynebacterineae、Sporosarcina，載荷值分別為0.974、0.924、0.919、0.913、0.856、0.855、0.814、-0.808。成分2中，載荷值較高的細(xì)菌屬為Mollicutes、Dehalobacter、Acetobacter、Syntronhus、Psychrobacter，載荷值分別為0.970、0.970、0.970、0.970、0.881。

圖11 按成分1和成分2劃分的窖泥樣品分布圖Fig.11 Distribution map of pit mud samples according to PCA

各個菌屬在不同品質(zhì)窖泥中的分布有以下特點。從成分1看：Sporobacter、Coriobacterineae、Clostridium、Cellulomonadaceae、Sedimenlibacter、Aminobacterium、Corynebacterineae在窖泥中所占比例與窖泥品質(zhì)呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系。由于Sporobacter能在厭氧條件下代謝產(chǎn)生有機酸和芳香族化合物[9-10]；Clostridium(梭菌屬)是一類嚴(yán)格厭氧菌，能在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生有機酸和醇類[11]；Cellulomonadaceae(纖維素單胞菌)能夠產(chǎn)生纖維素酶[12]，能夠提高釀酒原料的利用率；Aminobacterium(氨基桿菌屬)能夠在厭氧條件下降解氨基酸[13]；故品質(zhì)越高的窖泥越有利于白酒發(fā)酵過程，提高酒質(zhì)。而Sporosarcina在窖泥中所占比例卻與窖泥品質(zhì)呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。成分2看：Mollicutes(柔膜菌屬)、Dehalobacter(脫鹵素桿菌屬)、Acetobacter(醋酸桿菌屬)、Syntronhus、Psychrobacter(嗜冷菌屬)幾類菌都只在三級窖泥中發(fā)現(xiàn)有一定比例的分布，而在一、二級窖泥中均未檢測出。

表1 細(xì)菌的主成分特征值

2.3 窖泥酶活與微生物群落的相關(guān)性分析

窖泥微生物群落與酶活性相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示，放線菌門、變形菌門、互養(yǎng)菌門、厚壁菌門、綠彎菌門與窖泥中酶活性關(guān)系較為密切。說明這些菌門更多地參與了窖池中的生化反應(yīng)。厚壁菌門分別與蛋白酶、酸性磷酸酶的活性呈顯著正相關(guān)。綠彎菌門與脫氫酶活性呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，互養(yǎng)菌門分別與蛋白酶活性和過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，與脫氫酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。變形菌門分別與蛋白酶活、磷酸酶性呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。放線菌分別與蛋白酶和過氧化氫酶的活性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)，與酸性磷酸酶呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，與脫氫酶呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)。窖泥中微生物和脲酶活性的相關(guān)性都沒有達到顯著水平(p>0.05)。

表2 窖泥微生物群落與酶活相關(guān)性分析

注：*表示差異顯著(p<0.05)；**表示差異極顯著(p<0.01)。

脲酶是土壤中重要的酶類，分解尿素為微生物提供氮源，而相關(guān)性分析結(jié)果表明窖泥中微生物氮源來自于蛋白酶作用。窖泥原料雖來源于土壤，但經(jīng)過釀酒環(huán)境的長時間馴化，窖泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)和生理活動特點相對于土壤中的微生物已經(jīng)發(fā)生了一定的變化。窖泥品質(zhì)的優(yōu)劣主要是因為窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，進而表現(xiàn)出不同的酶活力。通過進行相關(guān)性分析，得到不同酶的活力與微生物群落的相關(guān)性，在一定程度上能反映出窖泥酶活與微生物群落之間的關(guān)系進而表征窖泥的品質(zhì)。故本研究對于更深入地進行窖泥品質(zhì)的劃分與評定具有一定的意義。

3 小結(jié)

本試驗通過測定不同品質(zhì)窖泥的酶活，了解了蛋白酶、酸性磷酸酶等酶在不同品質(zhì)窖泥中酶活力的變化趨勢；利用高通量測序技術(shù)對不同品質(zhì)窖泥的微生物群落進行研究，表明了不同品質(zhì)窖泥中細(xì)菌種類的多樣性及其規(guī)律性。通過對窖泥酶活指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與蛋白酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、脫氫酶活性的相關(guān)性達到了顯著或者極顯著的水平。由此可以得出，不同品質(zhì)窖泥的酶活力和微生物群落結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，窖泥的酶活可作為反映窖泥品質(zhì)的指標(biāo)以做深入研究。

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