楊曉，王畋，2，劉暢，黃瑩

（1.武漢躍萊健康產(chǎn)業(yè)有限公司研究院，湖北武漢430090；2.中國(guó)保健協(xié)會(huì)，北京100142）

大豆作為我國(guó)的糧食經(jīng)濟(jì)作物，種植面積極為廣泛，大豆中的大豆蛋白能夠補(bǔ)充人體所需蛋白質(zhì)，而且價(jià)格便宜，容易獲取，但大豆蛋白具有一定的豆腥味，而且加熱不容易凝固，遇酸會(huì)出現(xiàn)沉淀，不易溶于水等問(wèn)題，將大豆蛋白進(jìn)行深加工得到大豆肽能夠明顯改善這些問(wèn)題[1]。大豆肽是一種比大豆蛋白更具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物蛋白，由大豆蛋白通過(guò)酶解法[2]或者微生物發(fā)酵法[3]得到，主要成分為3個(gè)～6個(gè)氨基酸組成的肽，且相對(duì)分子質(zhì)量在300～700范圍內(nèi)[4]。研究表明大豆肽具有優(yōu)良的生物活性[5－7]，解酒[8]、降血脂[9]、提高免疫力[10-12]、抗氧化[13-15]、降低膽固醇[16]、促進(jìn)脂肪代謝[17]、促進(jìn)鈣和微量元素的吸收[18-19]以及抗疲勞[20-21]等。

?；撬崾且环N含硫的β-氨基酸，作為人體的一種條件必須氨基酸，以游離氨基酸的形式普遍存在于機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)，對(duì)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力及抗疲勞都有一定的作用[22]。黃精始載于《名醫(yī)別錄》，別名為“仙人余糧”、“救命草”、“老虎姜”等，為合科黃精屬多年生草本植物，有黃精、多花黃精和滇黃精等，在抗菌、解壓抗疲勞、抗衰老和治療心血管疾病、結(jié)核病、慢性肝炎等方面均有較好作用[23]?，斂Ш胸S富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸、纖維、維生素和礦物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有“南美人參”之譽(yù)[24-25]，此外，瑪咖含有瑪咖酰胺、瑪咖烯、生物堿、芥子油苷、甾醇和類固醇等主要次生代謝物，具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、提高生育力、抗炎癥、抗癌、抗氧化、抗病毒、降血壓、緩解抑郁和治療女性更年期綜合征等多種作用[26-27]。枸杞屬于茄科落葉灌木，其果實(shí)長(zhǎng)1 cm~2 cm，為明亮的橙紅色橢球漿果，具有抗衰老，保護(hù)神經(jīng)，抗骨髓抑制，提高睡眠質(zhì)量等生理作用[28]。

大豆肽膠囊以大豆肽為主要原料，并加以?；撬帷ⅫS精、瑪咖、枸杞制成。試驗(yàn)證明這些物質(zhì)以一定的比例配伍能夠顯著提高機(jī)體的抗疲勞能力，但配伍后得到大豆肽膠囊的安全毒理性有待進(jìn)一步研究，本文通過(guò)急性毒理學(xué)試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)、鼠傷寒沙門菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）、30天喂養(yǎng)試驗(yàn)共5項(xiàng)食品安全性毒理學(xué)試驗(yàn)，研究大豆肽膠囊的安全性，為大豆肽膠囊開發(fā)成為保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

大豆肽膠囊由武漢躍萊健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)對(duì)象

SPF級(jí)昆明種小鼠：上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（瀘）2013-0006；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（瀘）2013-0008。根據(jù)試驗(yàn)所需選用相應(yīng)體重和性別的小鼠。小鼠飼料由上海福貝寵物用品有限公司提供，登記證號(hào)：滬飼證（2014）04002。

1.3 主要儀器與藥品

ACS-3A型電子天平：上海奕泰機(jī)電設(shè)備有限公司；JH5101型電子天平：上海天平儀器技術(shù)有限公司；ME403E型電子天平：深圳市力達(dá)信儀器有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；貝克曼AU680全自動(dòng)生化分析儀：北京新邦天地醫(yī)療器械有限公司；希森美康XT-2000i血液分析儀：上海愷梵實(shí)業(yè)有限公司；ACS-3型電子稱：上海大和衡器常廠；HM340E切片機(jī)、STP120脫水機(jī)、HM340E包埋機(jī)、Varistain Gemini染色機(jī)：華俊醫(yī)療器械有限公司；Nikon eclipse80i顯微鏡：上海衡浩儀器有限公司；血液分析儀和試劑：希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司。

環(huán)磷酰胺：上海卓因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；TA97、TA98、TA100、TA102：美國(guó)分子毒理有限公司；對(duì)硝基喹啉、甲基甲烷磺酸、2-氨基芴、1.8-二羥基蒽醌、S-9混合液：上海皓鴻生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）》毒理學(xué)檢驗(yàn)方法進(jìn)行[29]。分別進(jìn)行如下試驗(yàn)：急性毒性試驗(yàn)[最大耐受量（Maximum Tolerance Dose：MTD）試驗(yàn)方法]，小鼠畸形試驗(yàn)，骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)（Giemsa染色法），鼠傷寒沙門菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）（平板摻入法），小鼠30天喂養(yǎng)試驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPPS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett法進(jìn)行多個(gè)劑量組與一個(gè)對(duì)照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，仍不齊則改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，若總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

大豆肽膠囊對(duì)雌雄性小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大豆肽膠囊對(duì)雌雄性小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Acute oral toxicity test of soybean peptide capsules on male and female mice

試驗(yàn)期間各組小鼠飲食活動(dòng)正常，生長(zhǎng)良好，毛色光澤度好，未見(jiàn)任何中毒癥狀；試驗(yàn)結(jié)束后解剖小鼠，大體觀察主要臟器均未見(jiàn)明顯異常，由表1可知，雌雄性小鼠死亡數(shù)量和死亡率為0只和0%，大豆肽膠囊對(duì)雌雄性小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的LD50均大于20 g/kg·BW，屬無(wú)毒級(jí)。

2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率見(jiàn)表2。

表2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率Table 2 Micronucleus rate of polychromatic erythrocytes in bone marrow of mice

由表2可知，受試樣品各劑量組PCE/NCE、微核率與陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組的微核率與陰性對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），故受試樣品的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性；且各劑量組PCE占RBC總數(shù)的比例不小于對(duì)照組的20%，表明樣品對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞無(wú)抑制作用。

2.3 精子畸形試驗(yàn)

動(dòng)物精子畸形發(fā)生率見(jiàn)表3。

表3 動(dòng)物精子畸形發(fā)生率Table 3 Sperm abnormality test in mice

由表3可知，受試樣品的各劑量組小鼠精子畸形率為0.78%、0.74%和0.70%，陰性對(duì)照組為0.72%，陽(yáng)性對(duì)照組為5.44%。受試樣品的各劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率與陰性對(duì)照組比較差異極顯著 （P＜0.01）。由此可知，受試樣品對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4 Ames試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)見(jiàn)表4、表5。

由表4、5可以看出，受試樣品的各劑量組和陰性對(duì)照組中空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組在加與不加S9活化系統(tǒng)的平板摻入法檢測(cè)的回復(fù)菌落數(shù)均小于溶劑對(duì)照的2倍，而其他陽(yáng)性對(duì)照組均超過(guò)自然回變菌落數(shù)的2倍以上。所以受試樣品的Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，即表明受試樣品在試驗(yàn)劑量 8 μg/皿～5 000 μg/皿范圍內(nèi)未出現(xiàn)誘變作用。

表4 Ames試驗(yàn)第一次試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of first test in Ames

續(xù)表4 Ames試驗(yàn)第一次試驗(yàn)結(jié)果Continue table 4 Results of first test in Ames

表5 Ames試驗(yàn)第二次試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of second test in Ames

2.5 30天喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.5.1 大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率

大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率見(jiàn)表6、表7。

由表6、表7可見(jiàn)，受試樣品各劑量組大鼠的體重、攝食量、增重及食物利用率與對(duì)照組相比，差異均不顯著（P＞0.05），這表明受試樣品在該試驗(yàn)條件下對(duì)大鼠的體重、攝食量、增重、食物利用率均無(wú)明顯影響，各試驗(yàn)組的大鼠生長(zhǎng)情況基本良好。

表6 雄性大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率結(jié)果（X±SD，n=10）Table 6 Results of weight，weight gain，food intake and food utilization rates in male rats（X±SD，n=10）

續(xù)表6 雄性大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率結(jié)果（X±SD，n=10）Continue table 6 Results of weight，weight gain，food intake and food utilization rates in male rats（X±SD，n=10）

表7 雌性大鼠體重、攝食量、食物利用率結(jié)果（X±SD，n=10）表 7 Results of body weight，weight gain，food intake and food utilization rates in female rats（X±SD，n=10）

2.5.2 大鼠臟器絕對(duì)重量、臟體比值

大鼠臟器絕對(duì)重量、臟體比值見(jiàn)表8、表9。

表8 大鼠臟器絕對(duì)重量（X±SD，n=10）Table 8 Absolute weight of organs in each group（X±SD，n=10）

表9 大鼠臟體比值（X±SD，n=10）Table 9 Ratio of organ to body weight in each group（X±SD，n=10）

由表8、表9可見(jiàn)，樣品各劑量組大鼠肝、腎、脾、睪丸的絕對(duì)重量和臟體比與對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明受試樣品在本試驗(yàn)條件下對(duì)動(dòng)物的臟器重量和臟體比均無(wú)明顯影響。

2.5.3 大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果

大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)表10、表11。

表10 大鼠血常規(guī)測(cè)定結(jié)果（X±SD，n=10）Table 10 Blood routine test result in rats（X±SD，n=10）

表11 大鼠血常規(guī)測(cè)定結(jié)果（X±SD，n=10）Table 11 Blood routine test result in rats（X±SD，n=10）

由表10、表11可見(jiàn)，各劑量組大鼠的血紅蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類與對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明受試樣品在該試驗(yàn)條件下對(duì)大鼠的血常規(guī)指標(biāo)無(wú)明顯影響。

2.5.3 大鼠生化學(xué)檢查結(jié)果

大鼠生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表12、表13。

表12 大鼠生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（X±SD，n=10）Table 12 Results of biochemical indexes in rats（X±SD，n=10）

表13 大鼠生化指標(biāo)的影響（X±SD，n=10）Table 13 Results of biochemical indexes in rats（X±SD，n=10）

由表12、表13可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，各劑量組雌雄大鼠的生化指標(biāo)檢測(cè)值與對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明受試樣品在該試驗(yàn)條件下對(duì)大鼠的生化指標(biāo)檢測(cè)值無(wú)明顯影響。

2.5.3 大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果

大鼠喂養(yǎng)30天后，進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察各組大鼠的臟器變化，未發(fā)現(xiàn)明顯病變，選擇高劑量及對(duì)照組大鼠，通過(guò)顯微鏡觀察進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。檢查結(jié)果如下：

肝臟：高劑量和對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊；肝細(xì)胞大小一致，細(xì)胞核大小均一，核膜、核仁清楚，細(xì)胞質(zhì)染色均勻。

腎臟：高劑量和對(duì)照組雄鼠分別有1例腎臟囊腫，其余大鼠腎皮、髓質(zhì)界限清楚，腎單位結(jié)構(gòu)正常，腎小球無(wú)炎性改變、纖維化、玻璃樣病變等，腎小管亦未見(jiàn)明顯病變。

脾臟：對(duì)照組雌鼠有1例紅髓輕度擴(kuò)張。其余動(dòng)物紅、白髓清楚，中央動(dòng)脈位居脾小體中央，小體無(wú)明顯萎縮，脾竇擴(kuò)張，脾小梁正常。

胃、十二指腸：高劑量和對(duì)照組大鼠腸胃表面粘膜正常，無(wú)炎性改變和糜爛、潰瘍形成。粘膜下、肌層、漿膜層均無(wú)炎性改變。

卵巢：高劑量和對(duì)照組大鼠卵巢內(nèi)可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡及排卵后形成的黃體、白體。

睪丸：高劑量和對(duì)照組大鼠精細(xì)胞發(fā)育正常。

由以上檢查結(jié)果可知，本次試驗(yàn)未見(jiàn)由該受試樣品引起的肝、腎、脾、胃、卵巢、睪丸等臟器引起的毒性病理改變。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)）和30天喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大豆肽膠囊的安全性毒理學(xué)進(jìn)行了研究，大豆肽膠囊對(duì)雌雄性小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的LD50均大于20 g/kg·BW，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，屬無(wú)毒級(jí)；遺傳毒性試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)）結(jié)果均為陰性；30天喂養(yǎng)試驗(yàn)表明，以1.25、2.5、5 g/kg劑量的受試樣品對(duì)大鼠進(jìn)行30天喂養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明各組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，大鼠體重、增重、攝食量、食物利用率、臟器重量、臟體比、血液學(xué)指標(biāo)、生化學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），大體解剖和組織病理學(xué)檢查，臟器未見(jiàn)毒性病理改變。因此可以判定大豆肽膠囊具有較好的食用安全性，為其開發(fā)成為保健食品提供理論依據(jù)。

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