李曉林，陳 瑩，吳陽升，林嘉鵬，汪立芹，黃俊成，賈 斌

(1．新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院 生物技術研究所/農(nóng)業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點開放實驗室，新疆 烏魯木齊 830000；2.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003)

卵泡從原始卵泡發(fā)育成為排卵前卵泡的過程中，卵泡的表面積和直徑隨之增加。卵母細胞從這些卵泡庫中小批量、周期性的生長，并經(jīng)歷一系列的分裂和成熟過程，最終排卵。經(jīng)卵泡刺激素(FSH)處理一月齡羔羊后，可導致比成年羊多10倍以上的卵泡發(fā)育[1]。故以羔羊為供體可以為胚胎體外生產(chǎn)提供大量的卵母細胞資源，從而縮短世代間隔。對卵泡發(fā)育相關基因的篩選與功能研究對于綿羊的育種具有重要科學意義和應用前景。課題組在比較激素誘導羔羊和成年羊激素誘導后發(fā)育卵泡顆粒細胞轉(zhuǎn)錄組差異時，鑒定300多個基因的轉(zhuǎn)錄水平有顯著差異。其中FSH誘導后羔羊TSP-1的表達顯著下調(diào)，而成年羊在激素誘導前后則無顯著變化[2]。故推測羔羊卵泡顆粒細胞中存在與成年羊不同的TSP-1信號通路，該通路可能與羔羊卵泡的超數(shù)發(fā)育數(shù)量有關，即與卵泡的募集有關。

凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1，TSP-1)是一種最早分離于血小板膜中的基質(zhì)細胞蛋白[3]。從結(jié)構(gòu)上來看，TSP-1包括一個肝素結(jié)合球形的N末端，3個類型的重復序列，一個RGDA序列及一個C末端[4]。其中N末端可以與低密度脂蛋白受體相關蛋白以及肝素硫酸蛋白多糖及一些整合素結(jié)合進而調(diào)節(jié)蛋白酶活性和對血管生成產(chǎn)生重要作用[5]。TSP-1具有多種生物學功能，可以與多種配體結(jié)合在血管生成、脂代謝、動脈粥樣硬化、腫瘤抑制和卵泡發(fā)育等方面發(fā)揮作用[6-8]。研究表明TSP-1廣泛分布于人的心、肺、腦[9]，牛的卵巢和羊的肺泡等組織中[10-11]，但關于該基因在綿羊除肺泡外各個組織中的分布和表達還沒有報道。

本文以新疆阿勒泰羊為研究對象，利用PCR擴增TSP-1 CDS區(qū)全長，對克隆的TSP-1的理化性質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)，功能域等進行生物信息學分析，同時構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹。在mRNA水平上分析TSP-1在不同組織和不同發(fā)育時期卵泡中表達差異，以期為后續(xù)深入研究TSP-1基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

阿勒泰羊選自新疆畜牧科學院綿羊繁育基地，在1周歲時選取5頭健康綿羊進行屠宰，取7個組織樣(心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢)，現(xiàn)場放于RNA保護劑中，4 ℃過夜保存，提取RNA。母羊屠宰后立即剪取卵巢并置于37 ℃生理鹽水中(含青、鏈霉素雙抗)，1～2 h內(nèi)運至實驗室。根據(jù)有腔卵泡直徑大小用剪刀和鑷子分離卵泡(<3 mm，小卵泡；3～5 mm,中卵泡；>5 mm，大卵泡)，用2 mL注射器抽取不同直徑卵泡中卵泡液[2]。每組有3個重復，每個重復包含來自3～5頭綿羊的卵泡混合成一個池(小有腔卵泡一般用10～15個卵泡做一個池；大有腔卵泡一般用3～5個卵泡做一個池)。

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank中綿羊TSP-1基因(XM_015096929.1)采用Primer 5.0軟件設計了3對引物(2對用于擴增TSP-1基因的CDS序列，1對為實時熒光定量引物)。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因(登錄號：AF017079.1)，序列見表1。所有引物自行設計后由上海生物技術服務有限公司合成。

表1 TSP-1基因的PCR擴增及實時熒光定量PCR引物

1.3 總RNA提取及cDNA合成

利用Trizol酚-氯仿法抽提綿羊各個組織和不同直徑卵泡總RNA。2%凝膠電泳后于凝膠自動成像儀(Gene)中成像。利用核酸測定儀檢測總RNA的純度和濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以各個組織和不同直徑卵泡RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行cDNA合成。反應體系20 μL:5xTransScriptAll-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL,總RNA 1 ng,加ddH2O至20 μL。

1.4 克隆測序

以綿羊第1條cDNA鏈為模板進行PCR擴增，體系為25 μL:cDNA 2 μL，2x Master SupermixTaq酶(北京全式金有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min,10 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用DNA柱式膠回收試劑盒(北京全式金)純化后與pMD19-T載體連接。挑取單克隆菌落，接種于含AMP的0.5 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min振蕩3～4 h。根據(jù)菌液PCR結(jié)果，挑選陽性克隆送測序(上海生工)。

1.5 實時熒光定量PCR

以2 μL不同組織cDNA為模板，25 μL體系另外包括：Green qPCR SuperMix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,RNase-free H2O 9 μL。PCR反應條件為:95 ℃預變性30 s;然后95 ℃ 5 s，引物特異Tm 15 min,55 ℃ 3 min，循環(huán)40次。熔解曲線分析:95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃/10 s的速率從55 ℃緩慢遞增到95 ℃。反應在Rochol LightCycler 480 II熒光定量PCR儀上進行，每次每一板上設置標準品(重復3次)和1個陰性對照。

1.6 統(tǒng)計分析

基因的mRNA表達定量采用相對Ct(ΔCt)法：目標基因Ct-GAPDHCt.ΔCt值在進行樣品間比較(ΔΔCt)：樣品2ΔCt-樣品1ΔCt。實時熒光定量PCR的最終結(jié)果計算公式為2-ΔΔCt。

1.7 系統(tǒng)進化樹分析

根據(jù)克隆得到的TSP-1基因序列和從GenBank下載的基因序列核苷酸序列，使用Mega6.0中的鄰接法(NJ)構(gòu)建進化樹。不同物種GenBank登錄號見表2。

表2 不同物種GenBank登錄號

1.8 生物信息學分析

利用DNAMAN軟件將TSP-1的核苷酸序列翻譯成氨基酸，通過DNAStar等生物信息學分析軟件和在線分析軟件預測蛋白的一級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、親/疏水性和信號肽、二級結(jié)構(gòu)等，預測所要使用的方法見表3。

表 3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預測方法(軟件或網(wǎng)址)

2 結(jié) 果

2.1 TSP-1基因PCR擴增

M：BM2000DNA Marker；1,2：片段1,2 PCR擴增結(jié)果；3：陰性對照M：BM2000DNA Marker;1,2:Results of 1,2 PCR amplification;3:Negative control圖1 TSP-1基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of TSP-1 gene

利用引物TSP-1-1和TSP-1-2,擴增阿勒泰羊組織cDNA中的TSP-1基因CDS區(qū)序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到片段長度分別為1 714 bp和2 200 bp，條帶單一，片段長度與預期大小相符(圖1)。

2.2 TSP-1基因CDS區(qū)序列及蛋白功能位點分析

經(jīng)測序和拼接后，得到3 519 bp的CDS區(qū)全長，共編碼1 172個氨基酸(圖2)。與GenBank上Texel羊序列(登錄號：XM_015096929.1)相比，TSP-1的編碼區(qū)序列在737 bp和2 113 bp處分別有一個C→T和A→G的突變，氨基酸分析顯示均為無義突變。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析

利用在線軟件分析，TSP-1蛋白分子式為C5482H8612N1712O1557S54，原子總量為17 541，分子量約為129.48 ku,帶正電荷和負電荷的氨基酸殘基數(shù)分別為184和119個，其理論等電點pI為4.72；經(jīng)計算TSP-1蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.24(>40)，脂肪指數(shù)為58.87,最大疏水性位于第9位氨基酸(Score:2.433)，最大親水性位于744位氨基酸(Score:2.878)；整體來看親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，總平均親水性為-0.713(<0)(圖3)；信號肽分析結(jié)果顯示TSP-1蛋白原裂解位點(C值)在和聯(lián)合裂解位點(Y值)在氨基酸19位評分最高(0.572和0.707)，信號肽存在于氨基酸的1～18位(圖4)；跨膜區(qū)分析TSP-1蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)分析TSP-1蛋白含13個α螺旋(alpha helix)，42個β折疊延伸鏈(extended strand)，103個轉(zhuǎn)角(turn)和86個無規(guī)則卷曲(random coil)(圖5)。

圖2 綿羊TSP-1基因的核苷酸序列及翻譯的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and translated amino acid sequence of TSP-1 gene in sheep

圖3 綿羊TSP-1蛋白的親/疏水性分析Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis of TSP-1protein in sheep

圖4 綿羊TSP-1蛋白信號肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of TSP-1 protein in sheep

圖5 綿羊TSP-1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.5 The secondary structure analysis of TSP-1 protein in sheep

利用在線軟件分析TSP-1蛋白的功能位點發(fā)現(xiàn)，可能存在6個N-糖基化位點，其中位于249,361,1 053位氨基酸的位點潛在值大于0.5(0.672 8、0.706 3和0.558 8)；該蛋白還存在44個潛在的磷酸化位點，包括25個Ser,10個Thr和9個Tyr(圖 6)。

圖6 TSP-1蛋白存在的N-糖基化和磷酸化位點Fig.6 N-glycosylation and phosphorylation sites in TSP-1 protein

利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫分析TSP-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1蛋白與TSP-3蛋白含有2個長重復區(qū)、3個短重復區(qū)、6個C型Ga離子結(jié)合位點和一個N型Ga離子結(jié)合位點(圖7)。

圖7 TSP-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.7 Functional domain of TSP-1 protein

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

圖8 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by NJ method

利用 Mega 6.0軟件構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進化樹,其中人與黑猩猩聚為一類，野馬和小鼠聚為一類，家雞與其他物種的遺傳距離較遠，綿羊與牛，野豬的遺傳距離較近(圖8)。

2.5 TSP-1基因在綿羊7個組織中的表達譜檢測

通過實時熒光定量PCR檢測了TSP-1基因在5頭阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、子宮中表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1基因在這7個組織中都有表達，其中在肝臟、肺臟和腎臟中高表達，在脾臟和子宮中中等表達，在心臟和肌肉中低表達。其中肝臟和肺中表達量與心臟相比差異極顯著(P<0.01)，腎臟與心臟表達量相比差異顯著(P<0.05)(圖9)。

1:心臟;2:肌肉;3:卵巢;4:脾臟;5:腎臟;6:肝臟;7:肺臟 1:Heart;2:Muscle;3:Uterus;4:Spleen;5:Kidncy;6:Liver;7:Lung圖9 TSP-1基因在綿羊組織中表達情況Fig.9 The tissues expression profile of TSP-1 gene in sheep

圖10 TSP-1基因在綿羊不同生長期卵泡中表達情況Fig.10 Different growth stages expression of TSP-1 gene in sheep

2.6 TSP-1基因在綿羊不同生長時期卵泡中表達情況

通過實時熒光定量PCR檢測了TSP-1基因在不同生長時期卵泡中表達變化。結(jié)果顯示，隨著卵泡直徑的增大，TSP-1基因的表達也逐漸升高。其中，大、小卵泡表達量差異顯著(P<0.05)(圖10)。

3 討 論

卵母細胞的成熟離不開卵泡液和顆粒細胞，卵泡液是前者發(fā)育成熟的重要場所，而顆粒細胞分泌的蛋白和激素則調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育[12]。研究表明，TSP-1在多種動物卵巢組織中表達且對卵泡發(fā)育有一定作用，如小鼠TSP-1基因的敲除，可導致卵巢卵泡發(fā)育數(shù)量顯著增高，而排卵數(shù)則顯著受到抑制。James等[13]認為TSP-1在卵巢上直接抑制了VEGF的表達從而調(diào)控血管的發(fā)生與卵泡的發(fā)育。TSP-1在大鼠竇狀卵泡早期和黃體期的顆粒細胞中均有表達，但對FSH不敏感。同時TSP-1可促進大鼠體外培養(yǎng)的顆粒細胞凋亡，但不依賴于血管發(fā)生的信號通路[14-15]。與大鼠顆粒細胞對FSH敏感性不同的是，F(xiàn)SH的刺激牛顆粒細胞可誘導TSP-1的表達[16]。作為最早發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子[17]，近年來TSP-1在腫瘤中的表達與預后關系研究中研究較多，已經(jīng)明確的是TSP-1的生物學功能受多種因子的調(diào)控，如：生長因子、細胞因子、癌基因等[18-20]。通過超排后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析比較推測，TSP-1基因可能在綿羊卵泡發(fā)育中具有調(diào)控作用。

本研究通過兩次PCR擴增獲得TSP-1基因CDS區(qū)序列。與NCBI上的預測序列對比發(fā)現(xiàn)兩個突變位點，翻譯成氨基酸比對發(fā)現(xiàn)均為無義突變。系統(tǒng)進化樹分析表明綿羊與牛，野豬的遺傳距離較近。將克隆到的核苷酸序列及翻譯成的氨基酸進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，TSP-1蛋白整體帶正電荷，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，整體來看親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域。對其跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽進行分析后發(fā)現(xiàn)，TSP-1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，在氨基酸的1～18位有一個信號肽。若蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)表明其可能是以膜受體的形式發(fā)揮作用，也可能是定位于膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白，信號肽則是引導新合成的蛋白質(zhì)向分 泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈。故本研究的結(jié)果表明，TSP-1蛋白能與其他的配體相互作用進而發(fā)揮其生物學作用。糖基化和磷酸化都是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾方式，通過在線軟件分析后發(fā)現(xiàn)，TSP-1蛋白可能存在6個N-糖基化和50個潛在O-糖基化位點，以及44個潛在的磷酸化位點。結(jié)果表明TSP-1蛋白在翻譯后中有豐富的修飾。同時分析發(fā)現(xiàn)TSP-1蛋白與TSP-3蛋白含有2個長重復區(qū)、3個短重復區(qū)、6個C型Ga離子結(jié)合位點和一個N型Ga離子結(jié)合位點。

研究表明，TSP-1在小鼠，大鼠，牛等動物的各個組織中均有表達。但在綿羊各個組織中的表達和分布報道較少[21]。本試驗研究表明TSP-1基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、子宮這7個組織中都有表達，其中在肝臟、肺臟和腎臟中高表達，在脾臟和子宮中中等表達，在心臟和肌肉中低表達。隨著卵泡直徑的增大，TSP-1基因的表達也逐漸升高。這在一定程度上反映了TSP-1基因可能在綿羊卵泡發(fā)育中具有重要作用。

4 結(jié) 論

本研究利用PCR擴增和克隆測序獲得了TSP-1基因CDS全長為3 519 bp，共編碼1 172個氨基酸。TSP-1蛋白為脂溶性親水蛋白，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，沒有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，在氨基酸1～18位存在1個信號肽，存在6個N-糖基化和44個潛在的磷酸化位點，包括25個Ser,10個Thr和9個Tyr。系統(tǒng)進化樹分析顯示，綿羊與牛的親緣關系較近，與人、小鼠和雞等親緣關系較遠。檢測不同組織和不同直徑卵泡中TSP-1基因發(fā)現(xiàn)：TSP-1基因在這7個組織中都有表達。同時隨著卵泡直徑的增大，TSP-1基因的表達也逐漸升高。本研究初步探討了TSP-1基因的結(jié)構(gòu)和功能，但該基因在卵泡發(fā)育過程中的作用和機制需進一步研究。

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