封竣淇,羅衛(wèi)星,張依裕, 蔡惠芬*,羅 錚,徐 偉,翁吉梅,陳 說

(1.貴州大學 動物科學學院/高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省仁懷市黔北麻羊原種場，貴州 仁懷 564500 )

【研究意義】黔北麻羊是經原產地長期自然環(huán)境選擇而成的貴州重要地方優(yōu)質山羊品種之一[1]。因其具有食性廣、適應性強、耐粗飼、適宜高寒山區(qū)飼養(yǎng)、肉質鮮、口感佳和膻味輕等優(yōu)點[2]而深受廣大消費者喜愛。近年來，隨著廣大居民消費觀念的轉變，對羊肉的需求量逐年增加，使黔北麻羊個體小、凈肉率低和生長較緩慢的缺點日益突出。因此，通過分子標記輔助育種，選育高大、生長性狀優(yōu)良和肉質好、成熟快的黔北麻羊對提高其養(yǎng)殖經濟效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Dickkopf-1(DKK1)基因最早于1998年在非洲蟾蜍胚胎細胞中被發(fā)現，2000年被證實其為Dickkopf(DKKS)家族成員之一，在脊椎動物中DKKS家族還有DKK2、DKK3及DKK4等成員。DKK家族是一個保守基因家族，其家族基因結構的共同特點是由含1個信號肽序列、2段富含半胱氨酸(Cys1、Cys2)的保守結構域DKK-N和輔酯酶折疊(colipase fold)組成[3]。Cys1和Cys2分別位于氨基末端與羧基末端，二者形成的保守結構域被可變連接區(qū)域分割，通常由50～55個氨基酸組成。Liu C等[4]研究表明，DKK1基因由4個外顯子和3個內含子構成，可影響機體腫瘤生成、毛羽發(fā)生和脂肪細胞的分化等，其保守結構域的存在對DKK1基因家族的生物學功能起著重要作用。近年來，前人對畜牧動物的研究主要集中在其骨骼形成調控、脂肪細胞分化及骨再塑等方面，其作用機理主要是DKK1基因編碼一種分泌性糖蛋白，通過與Wnt蛋白競爭性地結合低密度脂蛋白受體相關的蛋白5/6(LRP5/6)來阻斷經典Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制 Wnt/β-catenin信號通路下游基因的轉錄狀態(tài)，從而調節(jié)動物胚胎發(fā)育，參與其肌細胞生成、脂肪細胞分化、骨代謝、毛囊發(fā)育和腫瘤發(fā)展等。Qiang等[5]也在2008年通過實驗證實了DKK1基因對調節(jié)骨代謝的分子機制。因此，DKK1基因作為Wnt信號通路的拮抗物，是調節(jié)動物骨骼生長發(fā)育的重要基因?！颈狙芯壳腥朦c】以黔北麻羊為對象，采用DNA池結合PCR產物直接測序方法研究黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)及部分內含子的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)，應用生物信息學軟件拼接黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)序列，并對其編碼蛋白質進行生物信息學分析?！緮M解決的關鍵問題】為黔北麻羊DKK1基因的深入研究及其種質資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

130只黔北麻羊，由貴州省遵義市習水縣富興牧業(yè)有限公司(國家級黔北麻羊保種場)與貴州省仁懷市黔北麻羊原種場提供。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 瓊脂糖(Biowest)；血液基因組提取試劑盒(生工生物)；2×EsTaqMaster Mix(英濰捷基)；DNA Ladder 2 000 Marker(英濰捷基)。

1.2.2 儀器 PCR儀(Bio-rad公司)，凝膠成像系統(Bio-rad公司)，超微量紫外分光光度計(Therom)，電泳槽和電泳儀(北京六一)，微型掌上離心機(北京東林昌盛)，漩渦混合器(上海汗諾)，移液槍(Eppendorf)。

1.3 羊血樣品的采集

在黔北麻羊原種場，頸靜脈采集羊血后注入抗凝管，放于冰盒內迅速帶回實驗室，放入-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA的提取與DNA池的構建

通過血液基因組試劑盒提取試驗羊血液DNA，提取DNA用超微量紫外分光光度計測定其DNA濃度 。然后將DNA樣品濃度稀釋為100 ng/μl，每個DNA樣品各取3 μl混勻后構建黔北麻羊DNA池。

1.5 引物設計與PCR擴增

參考NCBI山羊DKK1基因(GenBank登錄號:NC_030833.1)，用Primer Premier 5.0軟件在編碼區(qū)設計3對特異性引物，用于擴增黔北麻羊DKK1基因編碼區(qū)序列及部分內含子序列，引物送英濰捷基生物技術有限公司合成，其引物序列見表1。

PCR反應體系為10 μl：5 μl 2×TaqPCR Master Mix試劑，2 μl 雙蒸水H2O，1 μl DNA樣品，上、下游引物各1 μl。

PCR反應條件：預變性溫度為95 ℃，時間5 min；變性溫度為95 ℃，時間30 s；退火時間為30 s；72 ℃延伸30 s；共32個循環(huán)；終延伸溫度為72 ℃，延伸7 min 30 s。PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果用凝膠成像儀觀察。剩余PCR產物保存于4 ℃環(huán)境備用。

1.6 序列檢測與生物信息學工具

1.6.1 序列檢測 PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇條帶明亮、清晰和膠片效果較好的PCR產物純化后，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。測序結果用DNAstar和BioEdit軟件進行比對分析，經手工拼接后獲得黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)序列，對其進行開放閱讀框分析，結合測序峰圖篩選SNP位點。

表1 黔北麻羊DKK1基因的引物序列、退火溫度及目的片段大小

1.6.2 生物信息學工具 采用Expasy-ProtParam及DNAstar軟件分析編碼產物的理化特性；采用Expasy-ProtScale進行疏水性與親水性預測；采用SignalP4.1預測蛋白信號肽；采用Expasy-TMpred和TMHMM2.0在線跨膜蛋白軟件預測跨膜結構域；用NetPhos 3.1 Server工具預測蛋白磷酸化位點；采用TargetP 1.1 Server工具預測亞細胞定位點；采用PORTER、SWISS-MODEL工具預測蛋白質二級結構和三級結構，采用MEGA6.0、DNAMAN軟件分析序列的同源性并構建系統發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 黔北麻羊DKK1基因的PCR擴增效果

D1.DKK1-1 primer; D2.DKK1-2 primer; D34.DKK1-34 primer; M.Marker 2000圖1 黔北麻羊DKK1擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DKK1amplification products of Qianbei Ma Goat

由圖1可知，黔北麻羊DKK1基因PCR擴增圖譜的條帶單一、清晰明亮、特異性好，與預期擴增的條帶大小一致，可用于后續(xù)研究。

2.2 黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)的序列比對

通過DNAstar和BioEdit軟件對測序結果進行手工拼接，并應用NCBI網站的ORF Finder程序對黔北麻羊DKK1基因的CDS區(qū)序列進行開放閱讀框分析，獲得1條全長為789 bp的核苷酸序列序列，共編碼262個氨基酸，起始密碼子為ATG,終止子密碼子為TAA(圖2)。序列比對結果結合測序峰圖(圖3)分析，篩選出8個SNPs位點，分別為第1內含子的C1626T位點，第3內含子的A3083G位點，編碼區(qū)的T3000C、T3228C、T3238C、G3240A、T3271A和T3411C位點。其中，T3271A為錯義突變，導致半胱氨酸(Cys)變?yōu)榻z氨酸(Ser)，而其他編碼區(qū)的SNP位點均為同義突變。同義突變雖然不影響編碼的氨基酸序列，但同義突變可引起最小自由能、外顯子拼接和蛋白質空間結構等改變，從而導致mRNA影響蛋白質表達量的變化，進而影響其功能。

2.3 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.3.1 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的理化特性 研究結果顯示，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的分子量為 28 349.17 D，分子式為C1197H1907N385O366S25，理論等電點為8.88，有負電荷殘基(Asp + Glu)20個、正電荷殘基 (Arg + Lys)31個，在280 nm處的消光系數為15 690，脂肪系數為61.22，含有20種常見氨基酸。其中，以丙氨酸(Ala)的含量最高，占氨基酸總量的11.1 %；色氨酸(Trp)含量最低，占氨基酸總量的0.4 %。黔北麻羊DKK1基因編碼產物的不穩(wěn)定指數為42.66，根據Guruprasad原則該值大于40。表明，此編碼蛋白相對不穩(wěn)定。

圖2 黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)的核苷酸和編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and coding amino acid in CDS region of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

圖3 黔北麻羊DKK1基因的8個SNPs突變位點Fig.3 Eight SNPs mutant sites of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

2.3.2 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的疏水性與親水性預測 由圖4可知，在黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的多肽鏈氨基酸序列中，以第16位亮氨酸(Leu)的分值最高，為2.778，表明其疏水性最強；第75位賴氨酸(Lys)的分值最低，為-3.067，表明其親水性最強。用Expasy-ProtParam工具預測DKK1基因編碼蛋白的親水性平均值為-0.448。整體上看，肽鏈中的親水性氨基酸數量高于疏水性氨基酸數量，結合預測的親水性平均值看，整個多肽鏈表現為親水性。

正值表示疏水，負值表示親水The positive is the hydrophobic and the negative the hydrophilicity圖4 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的疏水性與親水性圖譜Fig.4 Coding protein hydrophobicity and hydrophilicity of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

2.3.3 黔北麻羊DKK1基因的編碼蛋白信號肽和跨膜結構 研究結果表明，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白信號肽的平均值(S-score)為0.764S>0.5，預測該蛋白為分泌蛋白。由圖5看出，DKK1基因的編碼蛋白具有信號肽序列，剪切位點最有可能位于第31～32位氨基酸間；在第15～37位氨基酸間有1個典型的跨膜螺旋區(qū)，與該蛋白的疏水性區(qū)域基本一致。說明，DKK1蛋白可能是一種膜蛋白受體。

2.3.4 蛋白磷酸化與亞細胞定位預測 研究結果表明，黔北麻羊DKK1蛋白有25個磷酸化位點。其中，絲氨酸(Ser)14個，蘇氨酸(Thr)9個，酪氨酸(Tyr)2個。在黔北麻羊DKK1基因的編碼蛋白亞細胞中，有93.4 %的可能存在于細胞外，說明DKK1蛋白屬分泌型蛋白。

圖5 黔北麻羊DKK1基因的氨基酸序列信號肽圖譜Fig.5 Signal peptide mapping of amino acid sequence of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

圖6 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的三級結構Fig.6 The tertiary structure of coding protein of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

表2 黔北麻羊與8個物種DKK1氨基酸序列的同源性

注：山羊(XP_005698218.1)，綿羊(XP_011957844.1)，普通牛(NP_001192473.1)，野牛(XP_005904695.1)，馬(NP_001254731.1)，人(NP_036374.1)，豬(NP_001138856.1)，家鼠(NP_034181.2)。

Note：Caprahircus(XP_005698218.1);Ovisaries(XP_011957844.1);Bostaurus(NP_001192473.1);Bosmutus(XP_005904695.1);Equuscaballus(NP_001254731.1);Homosapiens(NP_036374.1);Susscrofa(NP_001138856.1);Musmusculus(NP_034181.2).

2.3.5 黔北麻羊DKK1蛋白的二級和三級結構預測 研究結果顯示，在黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的二級結構中，α-螺旋(H)占9.1 %，β-折疊(E)占11.5 %，無規(guī)則卷曲(C)占79.4 %。從α-螺旋(H)和β-折疊(E)結構所占比例看，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白屬于mixed型蛋白。該蛋白的三級結構主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成(圖6)，與二級結構一致；該編碼蛋白與同源構建蛋白模型(SMTL id：3s2k.1.C)擁有94.25 %的相似度，具有較高可信度。

2.3.6 黔北麻羊DKK1氨基酸序列的同源性與系統發(fā)育樹 同源性分析結果(表2)表明，黔北麻羊DKK1基因的編碼蛋白與普通山羊和綿羊的同源性均較高，分別為99.6 %和98.8 %；與普通牛和野牛次之，分別為93.2 %和92.7 %；與豬和家鼠較低，分別為83.4 %和72.1 %。

由圖7可知，用NJ 法構建9個物種DKK1氨基酸序列的系統發(fā)育樹與其生物進化的物種樹基本一致，符合物種進化規(guī)律。說明，該基因較保守。黔北麻羊與家鼠的遺傳距離顯示，不同物種的DKK1基因存在一定差異。

圖7 NJ法構建的9個物種DKK1氨基酸序列的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of DKK1amino acid sequence of 9 species

3 討 論

Dickkopf-1(DKK1)是一種Wnt信號通路可溶性胞外抑制劑，前人對人體DKK1基因的研究多集中在骨質疾病、腫瘤及癌癥等方面[6-8]。Tai N等[6]研究表明，DKK1抗體可加快骨形成和增加骨密度，可用于治療骨質疏松癥；Forget M A等[7]研究指出，幾種常見癌癥中的DKK1表達式可作為癌癥預后預測的依據。對動物DKK1基因的研究主要集中在生物學功能、機理研究及生產性狀的關聯分析方面。Hashimoto H等[8]研究發(fā)現，在斑馬魚胚胎發(fā)育早期，DKK1的表達量可影響其骨骼發(fā)育，說明DKK1基因的表達量對動物骨骼生長有調控作用，骨骼的發(fā)育可影響動物的體尺等生長性狀，而選育生長性狀優(yōu)良個體則能顯著和快速的提高其養(yǎng)殖經濟效益。因此，研究黔北麻羊DKK1基因的SNP位點與其生長性狀的相關性，尋找與生長性狀差異顯著的SNP位點，以提高黔北麻羊的生產性能。Liu等[4]研究表明，豬DKK1基因第二內含子G1757A的突變與豬眼肌面積呈顯著差異(P=0.0281)，AG型與GG型差異顯著(P<0.05)；眼肌面積是肉質性狀的代表性指標之一，與家畜產肉性能有很強的相關性，且DKK1基因對豬肉質的控制起著重要作用。因此，研究該基因與黔北麻羊肉質性狀的關聯性，以提高黔北麻羊養(yǎng)殖效益。曹貴玲等[9]研究發(fā)現，山羊群體產絨量與其DKK1基因的多態(tài)性有關，A為優(yōu)勢等位基因，其對產絨量有利；而黔北麻羊屬于肉皮兼用型山羊，屬粗毛羊品種，其羊毛價格低，建議今后開展相關研究。高建斌等[10]研究顯示，不同突變位點不同基因型秦川牛在體尺和肉質指標中存在不同程度的顯著差異；而黔北麻羊卻缺少相關研究，建議進一步研究黔北麻羊DKK1基因與體尺和肉質指標的關聯性，為其優(yōu)良品種選育工作的開展奠定基礎。

4 結 論

(1)與普通山羊的CDS區(qū)序列比對結果顯示，在黔北麻羊DKK1基因的CDS區(qū)序列中有8個SNP位點，分別為第1內含子C1626T位點，第3內含子A3083G位點，編碼區(qū)的T3000C、T3228C、T3238C、G3240A、T3271A、T3411C位點。其中，T3271A為錯義突變，導致半胱氨酸(Cys)變?yōu)榻z氨酸(Ser)，而其他編碼區(qū)的SNP位點均為同義突變。

(2)生物信息學分析結果表明，黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)由一條長789 bp的核苷酸序列構成，共編碼262個氨基酸，蛋白分子量為 28 349.17 D。

(3)DKK1基因編碼蛋白的疏水性與親水性預測結果顯示，整個多肽鏈表現為親水性。信號肽及跨膜結構預測結果表明，DKK1基因的編碼蛋白具有信號肽序列，剪切位點最有可能位于第31～32位氨基酸間；在第15～37位氨基酸間有1個典型的跨膜螺旋區(qū)。

(4)蛋白磷酸化與亞細胞定位預測結果表明，黔北麻羊DKK1蛋白有25個磷酸化位點，有93.4 %的可能存在于細胞外，說明DKK1蛋白是分泌型蛋白。研究結果顯示，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的二級結構主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成，屬于mixed型蛋白，且三級結構與二級結構一致。DKK1氨基酸序列對比和系統進化分析結果顯示，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白與普通山羊、綿羊和牛等物種均具有較高同源性；NJ法構建的黔北麻羊基因系統發(fā)育樹與其生物進化的物種樹基本一致。

(5)不同物種的DKK1基因在進化上均較保守，有一定程度的遺傳多樣性，并在生物體中影響其多個生長發(fā)育過程，因此，該基因可作為動物骨骼生長發(fā)育研究和相關疾病鑒定的重要候選基因。

[1]羅衛(wèi)星,史忠輝,劉貞德,等. 黔北麻羊種質特性研究初報[J]. 山地農業(yè)生物學報,2010,29(5):466-470.

[2]羅衛(wèi)星,張啟林,穆 林,等. 黔北麻羊的肉用性能和肉質特性研究[J]. 西南農業(yè)學報,2010,23(5):1706-1710.

[3]Koonin E V. A colipase fold in the carboxy-terminal domain of the Wnt antagonists-the Dickkopfs[J]. Current Biology Cb,1998, 8(14):R477.

[4]Liu C, Gao H, Zhai S, et al. Molecular characterization, chromosomal localization, expression profile and association analysis with carcass traits of the porcine dickkopf homolog1 gene[J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(3):1929-1934.

[5]Qiang Y W, Barlogie B, Rudikoff S, et al.DKK1-induced inhibition of Wnt signaling in osteoblast differentiation is an underlying mechanism of bone loss in multiple myeloma[J]. Bone. 2008,42(4):669-680.

[6]Tai N, Inoue D.[New Development in Osteoporosis Treatment. Anti-Dickkopf1 (Dkk1) antibody as a bone anabolic agent for the treatment of osteoporosis][J]. Clinical Calcium, 2014, 24(1):75.

[7]Forget M A, Turcotte S, Beauseigle D, et al. The Wnt pathway regulator DKK1 is preferentially expressed in hormone-resistant breast tumours and in some common cancer types[J]. British Journal of Cancer, 2007,96(4):646-653.

[8]Hashimoto H, Itoh M, Yamanaka Y, et al. Zebrafish Dkk1 functions in forebrain specification and axial mesendoderm formation[J]. Developmental Biology, 2000,217(1):138-52.

[9]曹貴玲,張渝潔,李 標,等.山羊Dkk1基因的結構、啟動子區(qū)的多態(tài)性及其與生產性狀的關聯分析[J].畜牧獸醫(yī)學報, 2010, 41(11):1394-1400.

[10]高建斌,昝林森,楊 寧,等.秦川牛DKK1基因SNPs檢測及其與體尺、肉質性狀的關聯分析[J].畜牧獸醫(yī)學報,2013,44(3):376-386.