王曉芳 徐少卓 王 玫 段亞楠 王海燕 盛月凡 毛志泉?

（1 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

（2 山東省果樹(shù)研究所，山東泰安 271000）

連作障礙（Hazard posed by continuous cropping to replanting）在全世界蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生［1］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)土傳病蟲(chóng)害是導(dǎo)致連作障礙的主要原因，如真菌中的柱孢屬（Cylindrocarpon）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、疫霉屬（Phytophthora）、腐霉屬（Pythium）及鐮刀菌屬（Fusarium）等［2-4］，各主產(chǎn)區(qū)的致病菌種差異很大；某些線蟲(chóng)也可能與連作障礙相關(guān)，如穿刺根腐線蟲(chóng)（Pratylenchus penetrans）［5］。因此，研究建立防治土傳病蟲(chóng)害的措施是緩解蘋(píng)果連作障礙的根本。土壤熏蒸（消毒）是破解連作障礙這一難題的有效措施，目前主要依靠化學(xué)熏蒸劑，如溴甲烷、棉隆和氯化苦等。溴甲烷能高效、廣譜地殺死各種有害生物，但其嚴(yán)重影響地球環(huán)境和人類健康，已被淘汰；其他化學(xué)藥劑雖尚未淘汰，但長(zhǎng)期大量使用會(huì)對(duì)環(huán)境和農(nóng)作物產(chǎn)生污染，危害人類健康［6］，而且化學(xué)熏蒸導(dǎo)致土壤酶活性顯著下降，極大地降低了農(nóng)業(yè)土壤的可持續(xù)生產(chǎn)力［7-8］。因此，發(fā)展可行的替代技術(shù)抑制土傳病蟲(chóng)害并進(jìn)行有效病蟲(chóng)害管理成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，生物熏蒸（Biofumigation）應(yīng)運(yùn)而生。

生物熏蒸是利用動(dòng)植物的有機(jī)質(zhì)在分解過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性殺生氣體抑制或殺死土壤中有害生物的方法。Smolinska等［9］研究表明，埃塞俄比亞芥菜（Brassica carinata）、黑芥子（B. nigra）和芥菜（B. juncea）含有較高的硫代葡萄糖苷（GSLs）能釋放出異硫氰酸酯（ITCs），對(duì)土壤中的尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）病原體有很好的抑制作用。目前，菊科植物、綠肥、家禽糞便等均被用作生物熏蒸材料以有效防治土傳病害及植物根結(jié)線蟲(chóng)［10-11］，但關(guān)于生物熏蒸的報(bào)道主要是使用蕓薹屬植物。本研究前期室內(nèi)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊（Tateges erecta）具有較強(qiáng)的抑菌效果。萬(wàn)壽菊為菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物，其含有的揮發(fā)性成分具有抗菌、抑菌及殺蟲(chóng)等多種生物活性。范志宏等［12］研究表明，萬(wàn)壽菊根提取物對(duì)西瓜枯萎病菌有明顯的抑制作用，其中以精油類的抑菌效果最好，且能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，有效減輕西瓜枯萎病菌對(duì)植株的毒害作用。作為一種商業(yè)化色素的新來(lái)源，萬(wàn)壽菊的種植面積日益增長(zhǎng)，對(duì)于萬(wàn)壽菊鮮花的利用研究較多，并已用于工業(yè)生產(chǎn)中。但對(duì)于萬(wàn)壽菊秸稈及葉子，采收后的萬(wàn)壽菊植株大部分被隨意拋棄或就地焚燒，造成資源浪費(fèi)且焚燒產(chǎn)生大量有害氣體，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染［13］。尋求高效、經(jīng)濟(jì)的萬(wàn)壽菊廢棄植株利用途徑是值得研究的課題，用萬(wàn)壽菊作為生物熏蒸劑克服蘋(píng)果連作障礙尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究用萬(wàn)壽菊風(fēng)干粉末對(duì)老齡蘋(píng)果園土壤進(jìn)行熏蒸，探討萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)蘋(píng)果幼苗及連作土壤環(huán)境的影響，以期為生產(chǎn)中利用生物熏蒸防治蘋(píng)果連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年4月—2016年12月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院、國(guó)家蘋(píng)果工程技術(shù)研究中心及作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

試驗(yàn)用土取自山東省泰安市滿莊鎮(zhèn)小王莊村25 a生老齡蘋(píng)果園，取自距樹(shù)干80 cm，去表層土后深10～40 cm的區(qū)域，多點(diǎn)隨機(jī)取樣，混勻備用。土壤類型為棕壤。土壤基本理化性質(zhì)如下：硝態(tài)氮銨態(tài)氮有效磷9.3 mg kg-1，速效鉀90.6 mg kg-1，有機(jī)質(zhì)5.3 g kg-1。

供試植物材料為實(shí)生平邑甜茶（M a l u shupehensisRehd.）蘋(píng)果幼苗，種子于4℃層積30 d左右，待種子露白后，于2015年12月9日播種于育苗基質(zhì)中，幼苗長(zhǎng)至6片真葉，備用。

熏蒸用萬(wàn)壽菊（Tateges erecta）為播種繁育的盆栽試材，于2015年4月中旬播種，8月中旬收集全株，用自來(lái)水沖洗干凈后，自然風(fēng)干，以粉碎機(jī)粉碎，過(guò)30目篩，裝入封口袋備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，分別為：①老齡蘋(píng)果園土壤對(duì)照（未作處理，CK）；②覆膜（未拌入萬(wàn)壽菊，F(xiàn)）；③萬(wàn)壽菊1.5 g kg-1+覆膜（1.5T+F）；④萬(wàn)壽菊6.0 g kg-1+覆膜（6.0T+F）；⑤萬(wàn)壽菊15.0 g kg-1+覆膜（15.0T+F）。

2016年1月10日進(jìn)行熏蒸處理，在每個(gè)泥瓦盆盆底（盆直徑23 cm，高18 cm）放置濾紙，將不同添加量的萬(wàn)壽菊（0、1.5、6、15 g kg-1）與老齡蘋(píng)果園土壤拌勻后裝盆，每盆裝3.0 kg混合土，澆透水，覆膜熏蒸，15 d后，去膜晾7 d。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的6葉平邑甜茶幼苗進(jìn)行移栽。每處理20盆，每盆2株幼苗，隨機(jī)排列，正常肥水管理，每個(gè)月施1次復(fù)合肥（氮磷鉀復(fù)混肥料15-15-15），每盆施用6 g，施肥后澆水，每3天澆水1次，每次澆水500 ml。

栽植幼苗生長(zhǎng)120 d取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。土壤樣品采集：每個(gè)處理取3盆作為3次重復(fù)，去掉表層土壤和盆周圍的土壤，取根際土，并將土壤裝入黑色塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)12目篩（1.70 mm）取大約500 g分裝至3個(gè)封口袋保存，一份4℃冷藏備用，用于土壤微生物數(shù)量的測(cè)定；一份風(fēng)干，用于土壤酶測(cè)定；一份-20℃冰箱保存，用于提取DNA，進(jìn)行末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析及實(shí)時(shí)熒光定量分析。植物樣品整株采集，輕輕抖落根部土壤，用清水沖洗干凈，將樣品及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，測(cè)定株高、干重等指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

生物量測(cè)定采用常規(guī)稱重方法。

根系形態(tài)指標(biāo)測(cè)定：將平邑甜茶幼苗根系用清水洗凈，放于盛有水的硬塑料盒中，在水中平鋪展開(kāi)，使用專業(yè)版WinRHIZO（2007年版）根系分析系統(tǒng)處理樣品圖像，記錄根長(zhǎng)度、根系表面積和根體積。

土壤酶測(cè)定參照關(guān)松蔭［14］的方法。脲酶測(cè)定采用比色法，以24 h后1 g土壤中NH3-N的質(zhì)量（mg）表示脲酶活性，用NH3-N mg g-1d-1表示。過(guò)氧化氫酶采用容量法，以1 g土壤的 0.1 mol L-1高錳酸鉀毫升數(shù)表示過(guò)氧化氫酶活性，用ml g-1表示。磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法，以1 g土壤的酚毫克數(shù)表示磷酸酶活性，用mg g-1d-1表示。蔗糖酶測(cè)定采用比色法，以24 h后1 g土壤中葡萄糖的質(zhì)量（mg）表示蔗糖酶活性，用mg g-1d-1表示。

土壤微生物測(cè)定：細(xì)菌、真菌、放線菌均用平板涂抹法測(cè)定，測(cè)定前計(jì)算水分系數(shù)。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基［15］。

樣品基因組總DNA的提取及純化按照E. Z.N.A. Soil DNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用于T-RFLP技術(shù)分析和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（qPCR）。

T-RFLP分析：①ITS-PCR擴(kuò)增。用于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）片段擴(kuò)增的引物采用帶羧基熒光素（FAM）熒光標(biāo)記的真菌通用引物ITS1-F-FAM和ITS4，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ITS1-F-FAM（5′→3′）：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4（5′→3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。ITS擴(kuò)增反應(yīng)體系為：12.5 μl 2 × Taq MasterMix，1 μl DNA模板，ITS1-F和ITS4（10 μmol L-1）各1.5 μl，加dd H2O至25 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性60 s，51℃退火60 s，72℃延伸60 s，共34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μl ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按照 PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，-20℃保存?zhèn)溆谩＂诿盖?。用限制性?nèi)切酶Hha I對(duì)上述PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為30 μl：含10 μl ITS-PCR純化產(chǎn)物、2 μl Hha I（10 U μl-1）、2 μl 10×Buffer，加dd H2O至30 μl。置于37℃水浴中溫育4 h，酶切完畢后65℃水浴20 min終止反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行真菌群落多樣性分析（多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)）、聚類分析和主成分分析［16］。

實(shí)時(shí)熒光定量采用CFX ConnectTMReal-Time System（Bio-Rad，美國(guó)）對(duì)土壤中層出鐮孢菌基因拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMKit TaKaRa試劑盒說(shuō)明步驟完成。25 μl PCR反應(yīng)體系：DNA模板1.5 μl；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl；引物各1 μl；ddH2O 9 μl。層出鐮孢菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s；共計(jì)40個(gè)循環(huán)［17］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行計(jì)算和作圖，通過(guò)SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，采用鄧肯（Duncan’s）新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)，用Origin 8.5完成對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的制圖。

2 結(jié) 果

2.1 萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)平邑甜茶幼苗生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照相比，不同添加量的萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理均對(duì)蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，均使平邑甜茶幼苗生物量有所增加（表1）。其中以6.0T+F處理的效果最好，其株高、地徑、地上部及根系干重分別為對(duì)照的3.6倍、1.5倍、8.1倍和13.1倍，與對(duì)照差異顯著。1.5T+F處理的分別為對(duì)照的2.1倍、1.1倍、3.9倍、5.8倍；15.0T+F處理的分別為對(duì)照的1.9倍、1.3倍、4.8倍、6.4倍（表1）。單獨(dú)覆膜處理對(duì)平邑甜茶幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，各項(xiàng)指標(biāo)分別為對(duì)照的1.3倍、1.2倍、2.2倍和3.1倍。

2.2 萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)平邑甜茶幼苗根系的影響

與對(duì)照相比，不同添加量的萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理均對(duì)蘋(píng)果幼苗根系生長(zhǎng)起到明顯促進(jìn)作用（表2）。其中以6.0T+F處理的效果最好，平邑甜茶幼苗的根長(zhǎng)度、根表面積、根體積及根尖數(shù)顯著增加，分別較對(duì)照增加了226.5%、333.0%、548.4%和142.7%，與對(duì)照差異顯著。1.5T+F處理的分別增加了52.4%、45.9%、82.8%、43.9%；15.0T+F處理的分別增加了42.4%、98.3%、178.9%、18.4%。單獨(dú)覆膜處理對(duì)平邑甜茶幼苗根系生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用，各項(xiàng)指標(biāo)分別較對(duì)照增加33.4%、41.4%、73.9%和3.2%，但與對(duì)照差異不顯著。

2.3 萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)蘋(píng)果連作土壤酶活性的影響

與對(duì)照相比，不同添加量的萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理顯著提高了連作土壤酶活性（圖1）。其中，脲酶、磷酸酶活性以6.0T+F處理的效果最好，分別較對(duì)照高103.6%、77.6%（圖1A、圖1B）；蔗糖酶活性以15.0T+F處理的最高，較對(duì)照高302.0%，6.0T+F處理的較對(duì)照高200.4%（圖1C）。過(guò)氧化氫酶活性以6.0T+F和15.0T+F處理的活性最高，均較對(duì)照高64.6%（圖1D）。單獨(dú)覆膜處理使脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性分別提高37.7%、20.3%、88.9%和10.8%。

表1 萬(wàn)壽菊生物熏蒸下平邑甜茶幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)Table 1 Growth indices of Malus hupehensis Rehd. seedlings in soils biofumigated with Tateges erecta powder

表2 萬(wàn)壽菊生物熏蒸下平邑甜茶單株幼苗根系的生長(zhǎng)Table 2 Growth of Malus hupehensis Rehd. seedling roots in soils biofumigated with Tateges erecta powder

2.4 萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

與對(duì)照相比，連作土壤中加入不同量的萬(wàn)壽菊熏蒸后，各處理土壤中的真菌數(shù)量明顯減少，細(xì)菌、放線菌數(shù)量顯著增加，細(xì)菌/真菌比值變大（表3）。以6.0T+F處理的效果最好，細(xì)菌/真菌比值為219.9，是對(duì)照的5.6倍；其次是15.0T+F處理的（137.0），為對(duì)照的3.5倍。說(shuō)明萬(wàn)壽菊生物熏蒸明顯改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使連作土壤真菌減少、細(xì)菌增加，向細(xì)菌型土壤轉(zhuǎn)化，微生物環(huán)境優(yōu)化，有利于根系生長(zhǎng)發(fā)育和植株生長(zhǎng)。

2.5 不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)多樣性指數(shù)、聚類分析和主成分分析（PCA）比較萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)土壤真菌多樣性的影響，了解連作蘋(píng)果園土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)特征變化。與對(duì)照相比，老齡蘋(píng)果園土壤加入萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理后，土壤真菌群落的多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)均有所下降，但優(yōu)勢(shì)度指數(shù)明顯增加（表4）。由此可見(jiàn)，萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理改變了土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，使土壤真菌群落的豐富度、多樣性和均勻度降低，某種真菌優(yōu)勢(shì)度明顯增加。

由圖2聚類分析可以看出，不同添加量萬(wàn)壽菊生物熏蒸的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與連作土壤完全獨(dú)立開(kāi)來(lái)，說(shuō)明萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理后明顯改變了連作蘋(píng)果園土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)。其中，6.0T+F處理和15.0T+F處理間關(guān)系較近，F(xiàn)和1.5T+F間關(guān)系較近。

圖1 萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)連作條件下脲酶（A）、磷酸酶（B）、蔗糖酶（C）和過(guò)氧化氫酶（D）活性的影響Fig. 1 Effects of biofumigation with Tateges erecta powder on soil enzyme activities（urease activity（A），phosphatase activity（B），invertase activity（C），and catalase activity（D））in soils under continuous cropping

表3 萬(wàn)壽菊生物熏蒸下土壤微生物數(shù)量Table 3 Population of soil microorganisms in soils biofumigated with Tateges erecta powder

表4 萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)土壤真菌多樣性的影響Table 4 Effects of biofumigation with Tateges erecta powder on the soil fungal diversity

圖2 不同處理間真菌末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）圖譜的聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of T-RFLP patterns of fungi in the soil relative to treatment

根據(jù)不同處理間的末端限制性片段（T-RFs）在圖譜中的分布及豐度進(jìn)行主成分分析（PCA）。根據(jù)主成分的提取原則，被選的主成分所代表的主軸總長(zhǎng)度占所有主軸長(zhǎng)度之和的大約85%即可，對(duì)各樣品獲得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，前2個(gè)主成分特征值的貢獻(xiàn)率總和為 99.16%，所以選取2個(gè)主成分來(lái)進(jìn)行分析。從圖3可以看出，萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理與老齡蘋(píng)果園土壤對(duì)照完全分開(kāi)，說(shuō)明萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理明顯改變了老齡蘋(píng)果園土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)。

2.6 不同處理土壤層出鐮孢菌數(shù)量

圖3 不同處理間真菌T-RFLP 圖譜的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of T-RFLP patterns of fungi in the soil relative to treatment

徐文鳳［18］在中國(guó)環(huán)渤海蘋(píng)果重茬園中分離出大量鐮孢屬真菌，分別為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）、腐皮鐮孢菌（F. solani）和串珠鐮孢菌（F. moniliforme）。致病性測(cè)定結(jié)果表明，層出鐮孢菌和串珠鐮孢菌致病性最強(qiáng)［18］。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（Real-time PCR）對(duì)層出鐮孢菌（F. proliferatum）的基因拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量分析（圖4）。結(jié)果表明，萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理的層出鐮孢菌基因拷貝數(shù)均低于CK，1.5T+F、6.0T+F、15.0T+F處理分別較對(duì)照低49.3%、57.9%、50.6%。單獨(dú)覆膜處理較對(duì)照降低了27.2%。說(shuō)明萬(wàn)壽菊生物熏蒸能夠顯著減少層出鐮孢菌的數(shù)量。

圖4 不同處理層出鐮孢菌的基因拷貝數(shù)Fig. 4 Gene copy number of Fusarium proliferatum in the soil relative to treatment

3 討 論

土壤添加劑可以改善土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤微生物群落，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物自身抗性，提高農(nóng)作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，所以，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中使用土壤添加劑已成為作物土傳病蟲(chóng)害生態(tài)防治的重要措施之一［19-20］。蘋(píng)果連作土壤中添加芥菜籽粉和白芥子粉等綠肥后，能明顯促進(jìn)嘎拉/M26幼樹(shù)生長(zhǎng)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，添加6.0 g kg-1的萬(wàn)壽菊粉末進(jìn)行生物熏蒸可顯著增加平邑甜茶幼苗的株高及生物量，尤其是對(duì)根系生長(zhǎng)促進(jìn)作用明顯。Arnault等［22］發(fā)現(xiàn)以洋蔥和韭菜加工廢料作為土壤生物熏蒸劑可明顯改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)草莓和蘆筍生長(zhǎng)，可使草莓和蘆筍增產(chǎn)15%～20%，與芥菜處理的效果相當(dāng)。研究中發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊低濃度（1.5 g kg-1）和高濃度（15.0 g kg-1）添加量的促生效果略差，1.5 g kg-1因?yàn)樘砑恿坎蛔?，熏蒸效果不理想?5.0 g kg-1雖然添加量大，但效果卻不是最理想的，室內(nèi)的抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊粉末加水后黏性較大，因此，施入土壤的量太大會(huì)導(dǎo)致土壤透氣性不良，土壤黏結(jié)，不利于根系生長(zhǎng)。

土壤酶是土壤中動(dòng)植物殘?bào)w分解、植物根系分泌和土壤微生物代謝的產(chǎn)物，是一類具有生物化學(xué)催化活性的特殊物質(zhì)，參與土壤中許多重要的生物化學(xué)過(guò)程，是土壤中最活躍的部分，直接影響著土壤的代謝性能，且能活化土壤有機(jī)質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為植物可吸收的無(wú)機(jī)物，其活性大小在一定程度上代表土壤肥力的高低，較高的酶活性水平，能在一定程度上保證作物在土壤肥力貧瘠的土地上生長(zhǎng)良好［23］。谷巖等［24］研究發(fā)現(xiàn)，大豆重茬使土壤脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性均顯著降低。蘋(píng)果連作土壤的過(guò)氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性降低，可能是連作使土壤環(huán)境惡化的表現(xiàn)之一，而澆灌3%濃度的有機(jī)物料發(fā)酵液可提高蘋(píng)果連作土壤的酶活性［25］。本研究中，老齡蘋(píng)果園土壤中加入萬(wàn)壽菊粉末生物熏蒸后，土壤酶活性顯著提高，綜合蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定結(jié)果看，以6.0 g kg-1處理的效果最好，這說(shuō)明適宜量的萬(wàn)壽菊粉末施入土壤后不僅具有良好的抑菌或滅菌作用，而且其植物組織腐爛分解后可能改良土壤的理化性質(zhì)特別是持水性、有機(jī)質(zhì)含量、肥力及通透性等，改善土壤的營(yíng)養(yǎng)條件，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增產(chǎn)。這與王艷芳等［26］在連作土壤中添加適量甲殼素能提高土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性的研究結(jié)果較為一致。

土壤微生物是土壤中活的有機(jī)體，是最活躍的土壤肥力因子之一［27］。土壤微生物種群在很大程度上決定著土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解、循環(huán)和能量流動(dòng)，通過(guò)調(diào)節(jié)土壤環(huán)境可以改變土壤微生物的種群組成和多樣性，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能［28］。植物連作后，由于長(zhǎng)期受同一類根系分泌物的影響，土壤微生物群落會(huì)發(fā)生選擇性富集，導(dǎo)致土壤微生物群落數(shù)量發(fā)生變化，擾亂了土壤微生物生態(tài)平衡，連作后土壤中細(xì)菌的數(shù)量總體下降，真菌的數(shù)量顯著上升，病原菌數(shù)量急劇增加，土壤微生物從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化，使病原菌更容易侵染植物而引發(fā)各種土傳病害［29］。因此，尋找適宜的控制土傳病蟲(chóng)害措施可有效防控連作障礙。隨著環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，各國(guó)學(xué)者致力于研究環(huán)保型熏蒸措施對(duì)土壤中致病病原菌或線蟲(chóng)的抑制或殺生作用。Lazzeri等［30］研究發(fā)現(xiàn)，芥子科植物（芥菜、芝麻菜等）作為殺生性綠肥顯著減少了腐霉菌屬繁殖體的數(shù)目。將高GSLs含量的蕓薹屬植物組織風(fēng)干制成殺生小球，施入土壤澆水熏蒸處理后發(fā)現(xiàn)，該處理與用純硫代葡萄糖苷和黑芥子酶處理同樣對(duì)腐霉菌（Pythiumspp.）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）有很好的熏蒸效果［31］。

本研究用平板涂布法結(jié)合末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)研究萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)連作蘋(píng)果園土壤中微生物數(shù)量和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響?；赥-RFLP圖譜，運(yùn)用多樣性指數(shù)和主成分分析比較了不同處理間真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老齡蘋(píng)果園土壤采取萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理后土壤中的真菌數(shù)量明顯減少而細(xì)菌、放線菌數(shù)量顯著增加，細(xì)菌/真菌比值顯著增加，以6.0 g kg-1處理的效果最好，細(xì)菌/真菌比值為219.9，土壤類型由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)變。同時(shí)，萬(wàn)壽菊生物熏蒸對(duì)連作土壤中真菌種類及豐度均產(chǎn)生了一定的影響，萬(wàn)壽菊生物熏蒸使老齡蘋(píng)果園土壤中真菌的多樣性、均勻度和豐富度降低，優(yōu)勢(shì)度增加，這與本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果［26］不一致，可能是因?yàn)槿f(wàn)壽菊生物熏蒸使某些真菌數(shù)量明顯增加，處于優(yōu)勢(shì)地位，也可能是因?yàn)槿f(wàn)壽菊植株內(nèi)存在著具有殺菌效果的內(nèi)生真菌。有研究［32］表明，有些植物內(nèi)生真菌具有顯著的生物熏蒸效果，具體原因有待于進(jìn)一步深入研究。Hollister等［33］最早利用高通量測(cè)序法分析芥菜籽粕（SM，釋放烯丙基異硫氰酸酯）對(duì)土壤真菌和細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)芥菜籽粕顯著影響土壤真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使真菌多樣性降低60%，與真菌病害相關(guān)的細(xì)菌類群豐富度增加（如芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬和鏈霉菌屬等），有效抑制了真菌病害發(fā)生。Hu等［34］研究發(fā)現(xiàn)，烯丙基型異硫氰酸酯使真菌數(shù)量減少85%，不同類型的異硫氰酸酯使真菌群落組成發(fā)生明顯改變，如烯丙基型異硫氰酸酯處理土壤后腐質(zhì)霉屬（Humicola）真菌增加，丁基型異硫氰酸酯處理土壤后被孢霉屬（Mortierella）真菌增加，但不同的異硫氰酸酯化合物對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。Weerakoon等［35］研究也發(fā)現(xiàn)，芥菜籽粉不僅對(duì)連作蘋(píng)果園土壤中腐霉屬（Pythiumspp.）病原菌具有抑制作用，而且改變連作土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)，這種土壤中原有真菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)整，很可能有助于芥菜籽粉抑制腐霉菌對(duì)蘋(píng)果根系的侵染，進(jìn)而緩解蘋(píng)果連作障礙 。Yim等［36］研究發(fā)現(xiàn)，芥菜生物熏蒸能夠促進(jìn)連作土壤中蘋(píng)果樹(shù)的生長(zhǎng)，且改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)真菌的影響較細(xì)菌明顯。Ascencion等［37］研究發(fā)現(xiàn)，在三種試驗(yàn)土壤中施用蕪菁、甘藍(lán)型油菜、芥菜熏蒸均能有效抑制白菜立枯絲核菌，抑制率分別為96.7%～100%、86.7%～100%、40%～100%，同時(shí)顯著改變了土壤中微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)，3種物質(zhì)熏蒸后土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯增加，真菌數(shù)量減少。

本研究在設(shè)置試驗(yàn)時(shí)，同時(shí)設(shè)置了單獨(dú)覆膜處理，單獨(dú)覆膜處理有一定的熏蒸作用，對(duì)幼苗及根系生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果不明顯，與對(duì)照差異不顯著。因此，在生產(chǎn)應(yīng)用中，連作土壤中添加適量的萬(wàn)壽菊粉澆水覆膜可使連作土壤由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)變，而且也有利于維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，緩解連作障礙，促進(jìn)連作條件下蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)發(fā)育。

萬(wàn)壽菊風(fēng)干粉末生物熏蒸對(duì)緩解蘋(píng)果連作障礙有較好的效果，為使生產(chǎn)上操作性更強(qiáng)，應(yīng)對(duì)萬(wàn)壽菊適宜劑型進(jìn)行試驗(yàn)，并配套相應(yīng)的技術(shù)措施。近年發(fā)展起來(lái)的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)深入研究連作對(duì)土壤微生物群落組成和功能變化是較好的技術(shù)手段，該技術(shù)能夠分析某些特定的菌群，如細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌、真菌及一些植物病原菌（鐮刀菌類、茄科勞爾氏菌）的變化情況，測(cè)定的微生物種類和數(shù)量更加多樣、豐富，結(jié)果也會(huì)更加可靠［27］。因此，下一步應(yīng)采用該測(cè)定技術(shù)深入研究萬(wàn)壽菊生物熏蒸處理后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和萬(wàn)壽菊的抑菌機(jī)理。

4 結(jié) 論

老齡蘋(píng)果園土壤中添加適量的萬(wàn)壽菊進(jìn)行熏蒸有助于增加有益細(xì)菌的數(shù)量，抑制土壤中病原真菌的繁殖，且有利于維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，這些變化有利于連作土壤朝著穩(wěn)定健康的方向發(fā)展，促進(jìn)連作條件下蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)發(fā)育，達(dá)到緩解蘋(píng)果連作障礙的目的。

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