徐江兵 王艷玲 劉 明 陳美君 林先貴

（1 南京信息工程大學(xué)，應(yīng)用氣象學(xué)院生態(tài)氣象環(huán)境研究中心，南京 210044）

（2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

土壤微生物是土壤的重要活性組成部分，它與土壤中營養(yǎng)元素循環(huán)、有機物質(zhì)分解等密切相關(guān)。同時，土壤微生物是土壤的敏感指標(biāo)，可用來表征土壤質(zhì)量的變化。周圍環(huán)境、農(nóng)業(yè)管理措施（如施肥、灌溉等）均會對土壤微生物群落活性、結(jié)構(gòu)多樣性等產(chǎn)生影響［1-2］。其中，測定土壤微生物活性有很多方法，傳統(tǒng)的方法如底物誘導(dǎo)呼吸［3］、酶活性［4］、BIOLOG微平板等［5］。這些方法具有一定的相關(guān)性，可從不同角度解釋、評價土壤肥力、利用方式和管理措施等對土壤微生物活性的影響。

BIOLOG是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種微平板技術(shù)。采用該技術(shù)可簡單、快速地獲知土壤微生物對多種碳源利用能力的差異。例如，采用BIOLOG技術(shù)發(fā)現(xiàn)添加菇渣肥料可提高土壤微生物對糖類物質(zhì)的利用能力［6］；長期施用有機肥改變了潮土對糖類、氨基酸和羧酸類碳源的利用特征［7］。但BIOLOG方法是一種可培養(yǎng)技術(shù)，在實驗操作過程中，稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)環(huán)境等因素均使樣品與原位土壤存在較大差異，進而增加了結(jié)果的不確定性［8］。同時有資料［5，8］表明，BIOLOG技術(shù)僅能表征土壤中比例較少且代謝較快的微生物活性，無法表征生長緩慢微生物的代謝特征。盡管該技術(shù)具有自身的缺點，但不可否認(rèn)，它對于評價樣品對碳源底物利用能力具有優(yōu)勢，借助一些統(tǒng)計分析手段可提供微生物的碳源偏好信息。

恒溫微量熱技術(shù)采用微量熱儀靈敏、精確地監(jiān)控樣品的熱效應(yīng)，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和生化領(lǐng)域［9］。由于熱散逸情況與微生物生長代謝過程吻合，因此，近年來它在土壤微生物領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注［10］。目前，已有很多研究［11-12］采用微量熱技術(shù)評價了不同重金屬、利用方式和管理方式等對土壤微生物熱代謝的影響，結(jié)果表明，通過微量熱法獲得的熱動力學(xué)參數(shù)與傳統(tǒng)的土壤基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸、土壤微生物生物量、微生物數(shù)量、脫氫酶活性等指標(biāo)密切相關(guān)［11，13］，可作為微生物活性的重要指標(biāo)。但需要注意的是，微量熱方法主要表征樣品的整體活性，其熱散逸包含了系統(tǒng)中所有的反應(yīng)及過程的熱量變化，缺乏特異性［14］，因此，需要結(jié)合一些特異性手段以提供更多生物活性方面的信息。

目前，大部分研究孤立地采用BIOLOG或微量熱方法對土壤微生物代謝特征進行研究，鮮有報道涉及兩種方法耦合以探索引起土壤微生物代謝變化的原因。由于微量熱技術(shù)主要通過額外添加碳源及氮源刺激微生物代謝，這與BIOLOG技術(shù)具有共性，因此，本文推測，將兩種方法耦合可以比較不同碳源的代謝差異，判斷樣品對不同碳源偏好特征。事實上，本研究的前期工作將這兩種方法耦合，研究了潮土（堿性土）及中性偏堿土壤中引起微生物活性變化的關(guān)鍵碳源因子，獲得較好的結(jié)果［15］。但該方法在酸性土壤中是否適合目前鮮有報道。因此，本研究選取一種典型的酸性土壤——紅壤為研究對象，將兩種方法耦合研究紅壤微生物對碳源的偏好信息。紅壤廣泛分布我國南方15?。▍^(qū)），總面積218萬km2，占我國國土面積1/5，是一種重要的農(nóng)田土壤［16］。研究影響紅壤微生物活性的關(guān)鍵碳源因子，對于該地區(qū)的農(nóng)田管理、政策制定均具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

旱地紅壤采自于中國科學(xué)院鷹潭紅壤生態(tài)試驗站定位試驗地（28°15′N，116°55′E）。該地區(qū)處于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫為17.8℃，年均降水量為1 788 mm，年蒸發(fā)量1 318 mm，無霜期258 d，成土母質(zhì)主要為第四紀(jì)紅黏土，土壤類型為紅壤（富鐵土），種植的作物為花生（Arachis hypogaea）。定位試驗始于2010年，設(shè)置三種不同施肥處理：不施肥處理（CK），單施無機肥處理（NPK），有機無機肥配施處理（OM），每處理三個重復(fù)。在NPK處理中，氮肥為尿素，磷肥為鈣鎂磷肥，鉀肥為氯化鉀，施用量分別為120 kg hm-2（以N計）、170 kg hm-2（以P2O5計）、180 kghm-2（以K2O計）。在OM處理中，腐熟的稻稈堆肥施用量為3 000 kg hm-2，并將N、P、K的施用量調(diào)整到與NPK處理一致的水平。所有的磷、鉀肥及有機肥均作為基肥一次性施入，氮肥則分成兩次施用：基肥40%，追肥60%。

1.2 土壤樣品采集

花生收獲后，在每個試驗小區(qū)按S型采集5份表層土壤（0～20 cm）樣品，混勻后按四分法取部分土壤裝在塑料袋里運至實驗室，過2 mm篩置于4℃冷藏。

表1 供試土壤基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of the tested soil

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH用pH計測定（水土比為2.5∶1）。土壤總有機碳和全氮分別采用重鉻酸鉀氧化法和凱氏定氮法測定，土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬藍(lán)比色法測定，速效鉀采用乙酸銨浸提提取—火焰光度法測定，具體步驟參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》［17］。測定結(jié)果見表1。

1.4 BIOLOG實驗

采用BIOLOG ECO微平板測定紅壤的微生物代謝活性，具體方法［18］如下：稱取10 g土壤置于90 ml滅菌生理鹽水中（0.85%NaCl溶液），以200 r min-1震蕩30 min，然后用生理鹽水稀釋至10-3，采用排孔加樣器接種至BIOLOG ECO微平板上，每孔加樣150 μl，每板三個重復(fù)。在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每隔12 h在讀板儀590 nm下讀數(shù)。微生物的代謝活性采用每孔顏色平均變化率（Average well color development，AWCD）表示。

式中，ODi為每個孔的吸光值與空白對照孔吸光值之差。

選取微生物對數(shù)生長期階段的AWCD值進行主成分分析（PCA），并選出與主成分相關(guān)系數(shù)r大于0.5的碳源，該類碳源作為微量熱實驗中備選碳源。

1.5 微量熱實驗

采用多通道微量熱儀TAM（TA Instrument，Delaware，美國）對土壤樣品中微生物熱代謝活性進行測定。具體的實驗步驟參照文獻(xiàn)［9］，并略作修改：先將待測樣品置于28℃下預(yù)培養(yǎng)一天，活化微生物以及恒定樣品溫度；預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，取1.2 g土壤樣品放入滅菌4 ml玻璃安瓿瓶中，添加0.2 ml含有5.0 mg葡萄糖和5.0 mg硫酸銨的溶液，以刺激和保證微生物生長；安瓿瓶用聚四氟乙烯封口，防止水分揮發(fā)和熱量丟失，然后將安瓿瓶置于微量熱儀中在28℃下培養(yǎng)，土壤微生物代謝活性采用計算機實時監(jiān)控、記錄，待熱功率信號平緩后實驗停止，獲得該樣品的功率—時間曲線。

從功率—時間曲線上，可以獲得以下參數(shù)：功率峰值為最大熱功率Pmax，μW；達(dá)到最大熱功率的時間Tmax，h；整個代謝過程中產(chǎn)生的總熱量Q，J g-1；對數(shù)生長期的微生物生長速率常數(shù)k，h-1。其中，生長速率常數(shù)k的計算公式如下：

式中，t為時間；Pt為在時間t時的熱功率值，μW；P0為對數(shù)生長期時初始的熱功率值，μW。

為測定BIOLOG實驗中與主成分相關(guān)的不同碳源對熱代謝的影響，將額外的5.0 mg的碳源加入含有5.0 mg葡萄糖和5.0 mg硫酸銨的溶液中，其余步驟同上。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和鄧肯（Duncan）法進行方差分析和多重比較（p=0.05），利用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同施肥處理土壤微生物群落水平生理代謝活性

BIOLOG ECO微平板結(jié)果（圖1）表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，AWCD先逐漸上升，而后趨于平緩，整體上呈現(xiàn)與微生物生長相似的特征，即延滯期、對數(shù)生長期。施肥引起紅壤微生物碳源利用能力變化，其中，OM與其余處理差異達(dá)顯著水平（p＜0.05）。例如，培養(yǎng)84 h時，OM處理AWCD為0.31，顯著高于CK、NPK處理的0.19、0.18（p＜0.05）。這說明有機無機肥混施能提高紅壤微生物的碳源代謝能力，但單施無機肥對AWCD影響不顯著。

圖1 BIOLOG實驗中AWCD變化曲線Fig. 1 AWCD curves in BIOLOG assay

選取對數(shù)生長期84h的AWCD值進行主成分分析（PCA），結(jié)果（圖2）表明，主成分1（PC1）、主成分2（PC2）分別解釋AWCD的24.6%、19.1%的變異。在PC1、PC2上，不同處理產(chǎn)生明顯分異，其中，OM處理處于PC1軸的正端，與CK、NPK處理區(qū)分開，說明OM處理中土壤微生物的碳源能力發(fā)生改變。在主成分分析中，與PC1密切相關(guān)且相關(guān)系數(shù)r＞0.5的碳源列于表2中，碳源包括L-精氨酸、L-蘇氨酸、D-甘露醇、糖原和D-纖維二糖，由于這些碳源與PC1相關(guān)性較高，推測這些碳源可能是引起土壤微生物群落代謝功能差異的原因。

圖2 BIOLOG實驗中主成分分析圖Fig. 2 Plot of principle component analysis（PCA）of carbon source utilization in BIOLOG assay

表2 與主成分1相關(guān)的碳源及相關(guān)系數(shù)（r＞0.5）Table 2 Carbon substrates high in Pearson’s correlation coefficient with PC1（r＞0.5）

2.2 不同施肥處理紅壤熱代謝活性

采用微量熱法對不同施肥處理中紅壤微生物熱代謝活性進行研究，獲得熱功率曲線（圖3），并擬合其熱動力學(xué)參數(shù)（表3）。結(jié)果表明，熱功率曲線存在停滯期、指數(shù)生長期及衰亡期。OM處理未顯著改變峰值Pmax、生長速率常數(shù)k、熱量釋放量Q（p＞0.05），但顯著改變了出峰時間Tmax，例如OM處理Tmax為26.07 h，顯著低于CK處理的28.78 h及NPK處理的28.04 h（p＜0.05），說明OM處理能顯著提高紅壤熱代謝活性。

圖3 不同施肥處理土壤熱功率曲線Fig. 3 Power-time curve of the soil relative to treatment

表3 不同施肥處理土壤熱動力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermal dynamic parameters of the soil relative to treatment

2.3 添加不同碳源后紅壤微生物熱代謝活性變化

為探明不同碳源底物對微生物熱代謝活性的影響，將BIOLOG實驗中與PC1相關(guān)性較高的碳源分別加入CK及OM處理的紅壤中，測定其對熱動力學(xué)特征的影響，并甄別BIOLOG結(jié)果中的碳源信息。結(jié)果（圖4和表4）表明，紅壤微生物的熱功率曲線及熱動力學(xué)參數(shù)因碳源底物而異。從曲線上看，在CK土壤中，添加糖原及L-精氨酸后，熱功率曲線變化較大：添加L-精氨酸后，出峰時間Tmax顯著縮短，但最大熱功率Pmax卻降低；添加糖原后，出峰時間Tmax較CK處理短，但較L-精氨酸長；對于最大熱功率Pmax，添加糖原后無顯著變化。而另外一些碳源底物（如D-纖維二糖、D-甘露醇等）對功率—時間曲線的峰型影響較小，表現(xiàn)為最大熱功率Pmax、出峰時間Tmax等參數(shù)均與CK處理相近。而對于L-蘇氨酸，其對最大熱功率Pmax影響較小，與CK差異不顯著，但顯著延長了出峰時間Tmax，說明它們對微生物熱代謝活性可能存在抑制作用。在OM土壤中，添加糖原提高了最大熱功率Pmax并降低出峰時間Tmax；盡管添加L-精氨酸降低了最大熱功率Pmax，但縮短了出峰時間Tmax；D-纖維二糖、D-甘露醇和L-蘇氨酸對最大熱功率Pmax無顯著影響，但延長了出峰時間Tmax。由此可見，供試紅壤對L-精氨酸及糖原響應(yīng)較為明顯，說明該類型紅壤偏好此類碳源；而其他與PC1相關(guān)性較高的碳源（如D-纖維二糖、D-甘露醇、L-蘇氨酸等）未能促進CK及OM處理的熱代謝活性，相反，還可能產(chǎn)生抑制效果。

圖4 添加不同碳源后土壤熱功率曲線Fig. 4 Power-time curves of the soils amended with different C substrates

3 討 論

施肥是提高作物產(chǎn)量、提升土壤地力的重要途徑之一。研究施肥對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，對于探明施肥作用機理、推動農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有積極意義。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，微生物是土壤重要組成部分，其代謝活性可用于表征土壤肥力狀況［5］。因而，本研究基于長期施肥處理平臺，探討提高土壤微生物代謝活性的碳源因子，可為合理施肥提供理論依據(jù)。

表4 添加不同碳源后土壤熱動力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermal dynamic parameters of soils amended with different C substrates

施用有機肥（或有機無機肥配施）是提高土壤養(yǎng)分［19］、增強土壤微生物代謝活性的有效途徑之一。有機肥中含有豐富的有機物質(zhì)，可作為微生物活動的碳源及能源，提高微生物代謝活動。已有研究表明，施用有機肥（或有機無機肥配施）后，土壤呼吸強度、脫氫酶活性［7，20］及土壤碳源底物利用能力［21］顯著增強，這與本研究中OM處理顯著提高紅壤微生物AWCD的結(jié)果是一致的。此外，由于微生物活動過程中會產(chǎn)生大量熱量，其變化趨勢與微生物生長特征類似，因此，可用熱動力學(xué)特征曲線來表示微生物代謝特征。文獻(xiàn)［22］表明，較短的出峰時間Tmax、較高的最大熱功率Pmax及較快的生長速率常數(shù)k表明土壤的代謝活性較高。由于土壤類型、肥料種類、耕作年限等因素的影響，不同研究中施肥處理對熱動力學(xué)參數(shù)影響存在差異，即會引起Tmax、Pmax及k部分或全部變化，但這些變化均表征了土壤熱代謝活性的變化。中國科學(xué)院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站的長期定位實驗研究［15，22］表明，潮土中有機無機肥配施顯著降低出峰時間Tmax，提高最大熱功率Pmax及生長速率常數(shù)k。本研究的紅壤中，盡管Pmax及k變化不顯著，但Tmax在OM處理中顯著降低，說明OM提高紅壤微生物代謝活性效果顯著。

BIOLOG方法通過測定土壤微生物對不同碳源利用情況表征微生物群落差異，而微量熱主要測定土壤微生物的整體活性，因而兩種方法在內(nèi)容涵蓋、信息解讀上存有差異［15］。與微量熱相比，BIOLOG微平板提供的碳源較多，可揭示較多的微生物群落偏好信息；但BIOLOG方法測定的是土壤稀釋液中微生物引起的吸光值變化率，這與原位土壤中情況差異較大。相較之下，微量熱法對土壤微生物干擾較小，其結(jié)果更接近原位土壤環(huán)境，它不僅可用于比較不同處理中土壤微生物代謝活性，還可用來甄別碳源偏好信息，但前提是需要以特異性方法（如BIOLOG方法）為先導(dǎo)。以本研究為例，有機無機肥配施提高了紅壤碳源代謝能力，使紅壤對某些碳源產(chǎn)生偏好（表2），但該結(jié)果與實際情況可能存在偏差。事實上，在添加相應(yīng)碳源的微量熱實驗中已證實這一點（圖4和表4）。例如，D-纖維二糖和D-甘露醇是引起B(yǎng)IOLOG中OM與其余處理分異的碳源因子（表2），但它們卻抑制了OM處理中熱代謝活性（較長的出峰時間Tmax），這部分說明了BIOLOG的局限性及耦合微量熱技術(shù)的必要性。

通過微量熱技術(shù)對BIOLOG中碳源偏好信息進行甄別時發(fā)現(xiàn)，無論是CK處理還是OM處理，添加L-精氨酸及糖原均顯著改變了紅壤的微生物熱代謝圖譜（圖4）。具體而言，添加L-精氨酸在降低CK及OM土壤的峰值Pmax的同時，縮短出峰時間Tmax。這與兩方面因素有關(guān)：一方面，L-精氨酸中碳（41%）和氮（32%）含量較高，可迅速被微生物利用，促進土壤（尤其酸性土壤）中氮素循環(huán)相關(guān)的生物化學(xué)過程［23-24］，提高微生物代謝活性，表現(xiàn)為出峰時間Tmax縮短；另一方面，由于L-精氨酸pH較高（堿性），微量熱實驗中過量的L-精氨酸可能會改變紅壤的性質(zhì)，對土著微生物產(chǎn)生不利影響，進而表現(xiàn)為添加L-精氨酸后紅壤微生物的熱代謝圖譜峰值Pmax降低。據(jù)此，本文推測L-精氨酸可在合適濃度下提高紅壤微生物的代謝活性。此外，糖原亦顯著縮短了出峰時間Tmax，但對Pmax無顯著影響，說明糖原亦能提高紅壤代謝活性，其原因可能在于糖原與土壤中磷素循環(huán)微生物有關(guān)。研究表明，糖原是磷素富集微生物（PAO）好氧合成的細(xì)胞內(nèi)能量貯存物質(zhì)［25］，在缺磷條件下，糖原可作為PAO的碳源及能源物質(zhì)，提高磷素的供給量［26-27］。在另一種缺磷土壤（潮土）中，也發(fā)現(xiàn)添加糖原后，潮土的熱代謝圖譜與直接添加磷肥的圖譜相近［15，22］，這從另一個角度說明，糖原可能與提高土壤中磷素周轉(zhuǎn)有關(guān)。本研究中，供試紅壤屬于典型的缺磷土壤［28］，因而，糖原可通過促進磷素循環(huán)微生物活性而提高熱代謝活性。綜上，本研究中有機無機肥處理中可能通過有機肥引入一些關(guān)鍵碳源因子（如L-精氨酸及糖原等），促進紅壤中氮、磷循環(huán)，進而提高紅壤代謝活性，但目前其微生物學(xué)作用機理尚不明了，需在以后的工作中加強探索。

4 結(jié) 論

有機無機肥配施提高了紅壤的碳源代謝及熱代謝活性。由于BIOLOG的局限性，引起有機無機肥配施處理分異的碳源未對紅壤微生物的熱代謝活性產(chǎn)生一致的促進作用，某些碳源甚至產(chǎn)生抑制效果。紅壤對L-精氨酸及糖原的熱代謝響應(yīng)較為明顯，說明這些碳源可能是提高紅壤微生物活性的關(guān)鍵碳源因子，施用富含L-精氨酸及糖原的有機肥對提高紅壤地力具有積極意義。

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