鮑志堅 胡旭 沈曉強

支氣管哮喘是一種由遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用引起的，由肥大細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等炎性細胞參與的炎性疾病[1]。其特點是氣道高反應性和可逆性氣流受限，癥狀主要是反復發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽，多在夜間或清晨發(fā)作或加劇[2]。根據發(fā)病誘因一般將哮喘分為變應性哮喘和非變應性哮喘。變應性哮喘由變應原誘導，表現為嗜酸性粒細胞增多、肥大細胞和Ⅱ型輔助性T細胞激活、IL-4和IL-13等細胞因子大量分泌、免疫球蛋白E水平升高。非變應性哮喘一般主要由大氣污染物（如粉塵顆粒、汽車尾氣等）、細菌或病毒感染及肥胖等環(huán)境因素刺激誘發(fā)，與變應原的有無沒有直接關系[3-5]。近年來隨著環(huán)境污染的日益加重，空氣中PM2.5的含量已越來越受關注。國內外大量研究顯示PM2.5超標能顯著提高哮喘患者的發(fā)病率及發(fā)病次數[6-8]，但具體機制不明確。因此，本研究進一步探討PM2.5所致的氧化應激對變應性哮喘氣道上皮固有免疫調控因子表達的刺激作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康清潔級BALB/c雌性小鼠24只，8～12周齡，體重約20～27g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。卵清蛋白購自美國Sigma公司，批號：A5503；IL-4和IFN-γ的ELISA試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司，貨號分別為GWB-1230FC和AF-315-05-100；IL-5和IL-13的ELISA試劑盒購自美國ADL公司，貨號分別為LE-07369和LE-06528。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型的制作 采用隨機數字表法將小鼠分為哮喘模型組、PM2.5輕度污染組、PM2.5重度污染組和正常對照組4組，每組6只。（1）哮喘模型組：分別于第1、7和14天腹腔注射卵清蛋白致敏液200μl（致敏液采用50μg的卵清蛋白加入到200μl的磷酸鹽緩沖液內溶解所成），于第21天起霧化吸入1%卵清蛋白溶液進行激發(fā)，每次持續(xù) 30min，1次/d，連續(xù) 5d；（2）PM2.5輕度污染組：致敏方法同哮喘模型組，于第21天起吸入PM2.5（90μg/m3）和霧化的1%卵清蛋白溶液進行激發(fā)；（3）PM2.5重度污染組：致敏和激發(fā)的方式同PM2.5輕度污染組，但吸入氣體內PM2.5濃度為200μg/m3；（4）正常對照組：該組小鼠以不含卵清蛋白的飼料進行飼養(yǎng)，分別于第1、7和14天腹腔注射同等體積的磷酸鹽緩沖液，激發(fā)方法同哮喘模型組[9]。

1.2.2 小鼠血清免疫調控因子水平的檢測 實驗結束后，處死小鼠，取小鼠血液10ml，靜置凝血后取血清，采用ELISA法檢測血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。1.2.3 小鼠氣道及肺組織的病理學觀察 取出小鼠肺臟，灌入10%甲醛溶液，并置于相同溶液中固定，隨后進行石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。光學顯微鏡下觀察小鼠肺內結構變化情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較 哮喘模型組和正常對照組血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。PM2.5輕度污染組、PM2.5重度污染組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平均高于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。PM2.5重度污染組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平均高于PM2.5輕度污染組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較（pg/ml）

2.2 各組小鼠氣道及肺組織病理學表現 哮喘模型組小鼠氣道上皮明顯增厚，官腔出現不同程度的狹窄，管壁周圍的炎性細胞浸潤跡象明顯，呈一種典型的哮喘急性期發(fā)作的表現，見圖1。PM2.5輕度污染組小鼠氣道上皮增厚較哮喘模型組更顯著，官腔狹窄程度較模型組加重，部分氣道痙攣，肺泡腔內分泌物增多，氣道管壁周圍及血管周圍均可見炎性反應，見圖2。PM2.5重度污染組小鼠，可以觀察到廣泛的氣道痙攣、收縮或閉塞，氣道內柱狀上皮顯著增厚，官腔明顯狹窄，氣道管壁周圍及肺組織內可見大量的炎性細胞浸潤，見圖3。

3 討論

哮喘作為一種以氣道反應增高為主要改變的疾病，其致病因素繁多。但當前國內外研究一致認為：哮喘的起病可能是個體生長環(huán)境及自身遺傳因素綜合作用的結果[10]。在哮喘發(fā)生、發(fā)展的過程中，自身的免疫因素在其中起到了至關重要的作用，其典型的病理表現為氣道的反應性增生、氣道周圍的炎性細胞浸潤、氣道分泌物增多以及機體的免疫調控因子釋放增加[11]。在哮喘的預防措施中，主要是通過避免個體與變應原接觸，從而達到降低甚至控制哮喘的發(fā)生率的目的。

圖1 哮喘模型組小鼠肺組織病理切片（HE 染色，×400）

圖2 PM2.5輕度污染組小鼠肺組織病理切片（HE染色，×400）

圖3 PM2.5重度污染組小鼠肺組織病理切片（HE染色，×400）

本研究顯示哮喘模型組和正常對照組血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明造模成功后血清中各細胞調控因子間具有可比性。該研究結論與當前大部分研究成果相一致。Chen等[12]通過對健康志愿者與哮喘患者（正常狀態(tài)下）的血清學指標分析顯示，兩者血清學指標比較差異均無統(tǒng)計學意義，其認為哮喘發(fā)作后體內的大量免疫調控因子，可能是機體通過自身的變態(tài)反應分泌的。因此，通過監(jiān)測哮喘患者血清內的免疫學指標可在一定程度上評估哮喘患者病情的進展程度。

本研究發(fā)現隨著PM2.5濃度的升高，小鼠體內的各種免疫調控因子均呈顯著地上升趨勢，且各組間差異均有統(tǒng)計學意義。說明PM2.5在一定程度上能夠誘發(fā)哮喘的發(fā)作，并加重哮喘病情的進展。目前研究認為PM2.5主要作用于非變應性哮喘[13]，PM2.5增加非變應性哮喘發(fā)病率的機制可能為PM2.5自身作為一種固體污染物，進入人體后可以直接刺激相應的呼吸道上皮，導致呼吸道上皮黏膜增厚，分泌物增加，因此誘導了哮喘的發(fā)生。然而本研究結果卻發(fā)現其對于變應性哮喘同樣有增加發(fā)病率的風險。近年來研究認為，PM2.5在空氣中并非只以固體顆粒物的形式存在，其自身就能吸附大量的致病菌或蛋白類物質，因此當這些物質隨著PM2.5一起被吸入哮喘患者體內之后，會快速地激發(fā)氣道內自身的固有免疫系統(tǒng)，從而分泌大量的免疫調控物質，以防止外來病原體通過氣道黏膜引起機體感染[14-15]。

雖然目前對PM2.5在變應性哮喘患者中的作用尚無共識，但越來越多的研究發(fā)現其可誘發(fā)變應性哮喘的發(fā)生。因此本研究認為PM2.5可增加變應性哮喘患者發(fā)病率的風險，其機制可能是通過調節(jié)氣道自身的固有免疫調控因子實現的，且PM2.5濃度越高，該效應也越明顯。

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