鄧晗，史瑾，王維，郝東，王俊，楊小琳

摘 要：目的：以畢赤酵母表達(dá)的重組人溶菌酶（hLYZ，以下簡(jiǎn)稱(chēng)hLYZ）發(fā)酵液為原料，建立一種hLYZ純化方法。方法：高速離心技術(shù)、膜過(guò)濾技術(shù)，超濾技術(shù)為主的粗純工藝；應(yīng)用離子交換色譜的精細(xì)純化工藝。結(jié)果：以該純化工藝可生產(chǎn)獲得單一組分的hLYZ，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及反相高效液相色譜C18柱檢測(cè)其純度可達(dá)98%以上。結(jié)論：本工藝得到的hLYZ純度大于98%、可用于進(jìn)一步工業(yè)化研究。

關(guān)鍵詞：hLYZ；超濾濃縮；離子交換層析；純化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2018）06-0176-03

Abstract： Objective： to establish a method for purification of human lysozyme （hLYZ） from the fermentation broth of recombinant human lysozyme （hLYZ） expressed by Pichia pastoris. Methods： high speed centrifugation， membrane filtration and ultrafiltration were used for crude purification， and ion exchange chromatography was used for fine purification. Results： a single component of hLYZ could be obtained by this purification process. The purity of hLYZ could reach more than 98% by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and RP-HPLC C18 column. Conclusion： the purity of hLYZ obtained by this process is more than 98%， which can be used for further industrial research.

Keywords： hLYZ； ultrafiltration concentration； ion exchange chromatography； purification

引言

溶菌酶（lysozyme）是一種專(zhuān)門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶，溶菌酶廣泛的存在于高等動(dòng)物組織及分泌物、鳥(niǎo)類(lèi)和家禽的蛋清中也含有此酶、其中以雞蛋清中含量最高[1-2]。它是一種無(wú)毒、無(wú)副作用的蛋白質(zhì)，具有一定的溶菌作用，可作為食品防腐劑。同時(shí)它具有抗菌、抗病毒等多種作用[3]。溶菌酶還具有破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的功能，因此溶菌酶成為基因工程及細(xì)胞工程必不可少的工具酶[4]。隨著生物工程的迅速發(fā)展，溶菌酶應(yīng)用價(jià)值將會(huì)越來(lái)越重要。目前用于溶菌酶分離純化的方法主要有結(jié)晶法[5-6]、離子交換法[7-8]，特別是現(xiàn)在采用的新技術(shù)如膜分離技術(shù)[9-10]、超濾法、親和-膜過(guò)濾技術(shù)等[11-12]。

與其他來(lái)源溶菌酶相比，人溶菌酶具有其優(yōu)越性和多種藥理作用，在臨床上也具有重要價(jià)值。 因此分離純化得到高純度hLYZ，產(chǎn)品用于進(jìn)一步科學(xué)研究就顯得尤為重要。但天然溶菌酶來(lái)源及其困難，DNA重組技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)是解決這一困難的有效途徑，現(xiàn)已利用化學(xué)合成或從人細(xì)胞組織中制備cDNA等途徑獲取人溶菌酶基因，并在大腸桿菌，酵母菌等表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，由于其表達(dá)水平不高，再加上后期純化工藝損失，總體收益較低， 因此目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于hLYZ純化工藝研究相對(duì)較少，本工藝運(yùn)用固液分離技術(shù)，超濾技術(shù)、離子交換層析技術(shù)得到純度大于98%的hLYZ產(chǎn)品，符合工業(yè)化生產(chǎn)要求，且工藝相對(duì)簡(jiǎn)單易操，可用于進(jìn)一步的工業(yè)化研究。

1 材料和方法

1.1 儀器

遼陽(yáng)陽(yáng)光三足式離心機(jī)（SSC600-NG）、0.22um除菌濾器、天津膜天膜中空纖維膜組件、武漢新力協(xié)力超濾膜組件、AKTA purifiers 100、北京六一電泳儀、日立HPLC 、C18層析柱（中科院大連化學(xué)物理研究所）。

1.2 試劑及材料

（1）試劑。十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸以及電泳相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；去離子水；超純水；乙腈及三氟乙酸均為色譜純；CM Sepharose Fast Flow（保賽恒成生產(chǎn)，批號(hào)：20131120）。對(duì)照品LYZ：sigma Lysozme hunman（L1667）。（2）材料。本公司201705003-50L批hLYZ發(fā)酵液。

1.3 方法

（1）hLYZ粗純。發(fā)酵液經(jīng)沉降式離心機(jī)轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心60分鐘進(jìn)行固液分離；收集上清，上清經(jīng)0.22um中空纖維膜過(guò)濾系統(tǒng)，去除殘余菌體、細(xì)胞碎片以及部分雜質(zhì)；收集0.22um濾出液用5k卷式超濾膜超濾濃縮脫鹽。（2）hLYZ陽(yáng)離子交換層析。a. 樣品處理：最終收集收集的濃縮液中加入0.05M磷酸二氫鈉溶液，調(diào)節(jié)pH7.5-8.0，電導(dǎo)6.0-7.0 mS/cm，配成上樣溶液備用。b. CM陽(yáng)離子交換層析純化：配制流動(dòng)相A：pH7.6 50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5-8.0之間，電導(dǎo)6.0-7.0 mS/cm；B：pH7.6 50mM磷酸鹽緩沖液，1M NaCl，pH7.5-8.0之間。將a中的hLYZ樣品上CM FF層析柱，樣品上樣完成后，用A相平衡，10%B相洗脫為雜質(zhì)，16%B洗脫液為hLYZ。

1.4 分析檢測(cè)

（1） Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)。hLYZ分子量為14.7Kd，故采用15%的分離膠分別對(duì)粗純樣品以及離子交換層析樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，先60v電壓 60min，再120v電壓150min。電泳完成后用固定液固定30min，再用R250染色30min，最后用脫色液脫色。（2）HPLC對(duì)hLYZ純度分析。采用HPLC對(duì)純化后hLYZ進(jìn)行純度分析，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相A：生理鹽水+0.1%TFA；B相為60%已腈+40%生理鹽水，色譜分析程序?yàn)?0B-70B 30min。檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。

2 結(jié)果

2.1 hLYZ純化

hLYZ發(fā)酵液先進(jìn)行固液分離；去除酵母細(xì)胞以及不溶性雜質(zhì)，在過(guò)0.22um中空纖維膜過(guò)濾系統(tǒng)，進(jìn)一步去除殘余菌體、細(xì)胞碎片以及部分大分子物質(zhì)等；最后用5k卷式超濾膜超濾濃縮脫鹽出去部分小分析物質(zhì)。

將5k脫鹽濃縮后的hLYZ加入0.05M磷酸二氫鈉溶液，調(diào)節(jié)pH7.5-8.0，電導(dǎo)6.0-7.0 mS/cm，分別用10%，16%的B相進(jìn)行階梯洗脫，16B洗脫為目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1。

2.2 Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)

對(duì)分離純化得到的hLYZ采用Tricine-SDS-PAGE電泳分分析檢測(cè)其純度，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，分離得到的hLYZ分子量在14.4kd，與對(duì)照品LYZ電泳遷移位置一致，且整個(gè)電泳條帶中雜帶較少，純度較高。

1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：對(duì)照品LYZ；3：純化后hLYZ

2.3.HPLC純度分析

經(jīng)高效液相色譜分析表明：純化后hLYZ出峰時(shí)間為16.03min，對(duì)照品hLYZ出峰時(shí)間為15.96min。純化后hLYZ與對(duì)照品hLYZ出峰時(shí)間基本一致，采用面積歸依法計(jì)算峰面積，得到hLYZ產(chǎn)品純度98.3%，hLYZ產(chǎn)品檢測(cè)色譜圖如圖3 ，hLYZ對(duì)照品出峰時(shí)間如圖4。

3.結(jié)束語(yǔ)

本方法采用傳統(tǒng)的固液分離技術(shù)、過(guò)濾技術(shù)以及超濾技術(shù)得到hLYZ粗品，經(jīng)一部陽(yáng)離子交換層析得到純度位98.3%的hLYZ產(chǎn)品。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于hLYZ的研究較少，且大部分集中在對(duì)蛋清等其他來(lái)源的溶菌酶的研究，而對(duì)人溶菌酶的研究相對(duì)較少，分離純化方面的研究鮮有報(bào)道，本工作初步建立了一種以超濾過(guò)濾技術(shù)粗純，陽(yáng)離子交換層析技術(shù)精純的hLYZ高純度分離純化工藝，工藝進(jìn)一步優(yōu)化后，有望進(jìn)行高純度大規(guī)模的生產(chǎn)。

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