李敏州，武 忠，張瑞霞，高 巍，趙凱瑩

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是臨床常見(jiàn)而難治的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的首位病因(約占35%)［1］。由于該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，故無(wú)理想的防治藥物，因此探討DN的發(fā)病機(jī)制、研究有效的防治藥物，已成為該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種腎臟疾病發(fā)展至終末期的必經(jīng)階段，其病變程度更能體現(xiàn)腎功能的惡化程度［2-3］。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelialmesenchymal transdifferentiation，TEMT)被認(rèn)為是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要機(jī)制［4］，故對(duì)TEMT進(jìn)行干預(yù)治療可能成為防治DN的有效措施。本研究擬通過(guò)建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型，采用中藥太靈丹治療，并與纈沙坦進(jìn)行對(duì)照，觀察中藥太靈丹對(duì)糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，為臨床防治糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2009-0004。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度控制在22℃左右，濕度60%，12小時(shí)明暗交替照明。

1.2 藥物與試劑 太靈丹，主要藥物組成：太子參，靈芝，丹參，牡丹皮，赤芍，桃仁，紅花，生黃芪，當(dāng)歸，熟大黃，枳實(shí)，甘草等(由內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院制劑室制備)。纈沙坦膠囊(商品名代文，北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X1006)。尿素氮試劑盒(批號(hào)：C013-1)、血肌酐試劑盒(批號(hào)：C011-1)、尿蛋白定量測(cè)試盒(批號(hào)：C035-2)、糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)：A056-1)、甘油三酯測(cè)定試劑盒(批號(hào)：A110-2)（以上藥物均購(gòu)自南京建成生物工程研究所）。TGF-β1抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab92486），E-cadherin抗體(美國(guó) CST公司，批號(hào)：3195S），α-SMA 抗體(美國(guó) Abcam公司，批號(hào)：ab32575)，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)Jackson公司，批號(hào)：111065003)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(美國(guó)Jackson公司，批號(hào)：016030084)，DAB顯色液(北京華肽先鋒生物科技有限公司，批號(hào)：41207-1)。

1.3 儀器 WL9-ONETOUCH Ultra穩(wěn)豪血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生)；7160全自動(dòng)生化分析儀(日本日立)；奔騰MMX多媒體微機(jī)(MIAS2000型圖像分析系統(tǒng))；6500i光學(xué)顯微鏡(中國(guó)重光)。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分成正常對(duì)照組10只，喂食普通飼料(12%脂肪，60%碳水化合物，28%蛋白質(zhì))。其余60只Wistar大鼠飼以高糖高脂飼料(58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白質(zhì))，自由攝食、飲水，并腹腔注射STZ 30 mg/kg，72小時(shí)后測(cè)血糖和尿糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖4＋以上者為模型成功，并按大鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為造模組、太靈丹低、中、高劑量組、纈沙坦組，每組12只。

1.4.2 給藥 太靈丹低、中、高劑量組分別以生藥 5、10、20 g/kg·d 灌胃，纈沙坦組按 10 mg/kg·d灌胃，1次/d，正常對(duì)照組和模型組大鼠給予等量去離子水灌胃。定期測(cè)體質(zhì)量與血糖，連續(xù)14周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 生化檢測(cè) 處死前，大鼠禁食水24小時(shí)，剪尾用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖水平；代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿液，CBB法測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量；10%水合氯醛麻醉下腹主動(dòng)脈取血致死，比色法檢測(cè)全血糖化血紅蛋白(HAb1c)；分離血清，用苦味酸法測(cè)定血肌酐(Scr)水平、二乙酰肟比色法測(cè)定血尿素氮(BUN)、單試劑GPO-PAP法測(cè)定甘油三酯(TG)水平。

1.5.2 腎臟病理檢查 大鼠處死后立即摘取左側(cè)腎臟，剝?nèi)グぃ?0%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成 2 μm 連續(xù)切片，經(jīng)HE、PAS 和 Masson 染色后，在中國(guó)重光6500i光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的病理形態(tài)學(xué)改變。雙盲給予HE染色下腎間質(zhì)損傷病變計(jì)分，小管間質(zhì)損害的特征按Banff分級(jí)［5］進(jìn)行0～3+半定量計(jì)分：無(wú)變化評(píng)0分；輕度改變?cè)u(píng)1分(病變范圍＜25%)；中度評(píng)2分(病變范圍26%～50%)；嚴(yán)重評(píng)3分(病變范圍＞50%)。記錄連續(xù)不重疊的15個(gè)200倍視野的數(shù)值，取其平均值來(lái)比較每例切片的腎小管間質(zhì)區(qū)域病變的程度。

1.5.3 免疫組化 石蠟包埋的4 μm連續(xù)切片，按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行α-SMA、E-cadherin及TGF-β1染色，DAB顯色，脫水，透明封固。結(jié)果判斷：PBS替代一抗作為陰性對(duì)照組。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果，表示有標(biāo)記蛋白的表達(dá)。根據(jù)腎小管上皮細(xì)胞的染色范圍判斷陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。IHC半定量結(jié)果評(píng)定：根據(jù)染色程度和范圍進(jìn)行分析評(píng)定。每例切片200倍下觀察20個(gè)互補(bǔ)重疊腎間質(zhì)視野，根據(jù)染色程度和著色范圍［6］進(jìn)行分析評(píng)定。將每張切片的染色程度和范圍得分相乘即為其最后得分。分別由2名醫(yī)師雙盲進(jìn)行積分，取其平均值。見(jiàn)表1。

表1 IHC著色程度及范圍評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及血糖 正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量、空腹血糖及HAb1c均明顯低于模型組(P＜0.01或0.05)，太靈丹高、中、低劑量組及纈沙坦組以上指標(biāo)亦低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組大鼠的相對(duì)腎重較正常對(duì)照組大鼠有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 24小時(shí)尿蛋白定量及血生化水平 正常對(duì)照組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量明顯低于模型組(P＜0.01)，各治療組尿蛋白定量均低于模型組，且太靈丹組各劑量與模型組24小時(shí)尿蛋白定量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組TG明顯低于模型組(P＜0.01)，太靈丹各劑量組及纈沙坦組的TG水平均較模型組有所下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組小鼠體質(zhì)量及血糖的變化(χ±s)

表2 各組小鼠體質(zhì)量及血糖的變化(χ±s)

注：＊與表示正常對(duì)照組比較，P＜0.01

組別 只數(shù) 體質(zhì)量/g 體質(zhì)量/腎質(zhì)量(×10-3)空腹血糖/(mmol·L-1) HAb1c/%正常對(duì)照組 10 236.71±8.44 5.57±0.43 4.87±0.24 4.40±0.20模型組 12 279.88±16.06＊ 6.37±1.85 23.4±4.31＊ 12.6±0.98＊太靈丹中劑量組 12 236.84±17.39＊ 5.93±0.30 18.1±3.95＊ 11.5±2.57＊太靈丹低劑量組 12 241.99±18.30＊ 5.92±0.65 18.0±1.88＊ 12.0±0.98＊太靈丹高劑量組 12 238.48±16.64＊ 5.83±0.45 17.9±2.12＊ 11.8±1.63＊纈沙坦組 12 254.68±18.54＊ 5.52±0.53 19.2±3.02＊ 12.3±2.31＊

表3 各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量及血生化水平的變化(χ±s)

2.3 腎臟病理改變 正常對(duì)照組：腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，腎小管上皮細(xì)胞呈方形，大小一致，排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)中未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，腎間質(zhì)損傷評(píng)分為0分；模型組：腎小球肥大，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多及腎小管上皮細(xì)胞大量萎縮、空泡變性，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)損傷評(píng)分為(2.78±0.33)分。而太靈丹各劑量組和纈沙坦組相似，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞呈小灶性浸潤(rùn)，少許上皮細(xì)胞腫脹，少部分腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯纖維化，腎間質(zhì)損傷評(píng)分分別為(2.34±0.31)分、(2.23±0.22)分，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 E-cadherin、α-SMA 及 TGF-β1表達(dá) E-cadherin：正常對(duì)照組小鼠腎小管上皮細(xì)胞有較強(qiáng)的不均勻棕黃色細(xì)顆粒表達(dá)，且明顯高于其余各組小鼠(P＜0.05)，與模型組相比，太靈丹各劑量組及纈沙坦組E-cadherin表達(dá)增加(P＜0.01)，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

α-SMA及TGF-β1：其余各組與正常對(duì)照組比較，小鼠腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA及TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，經(jīng)太靈丹各劑量組及纈沙坦組，上訴指標(biāo)的表達(dá)較模型組明顯減弱(P＜0.01)，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin、α-SMA及TGF-β1的表達(dá)(χ±s)

3 討論

RIF受多種因素的影響，其中TEMT在腎間質(zhì)纖維化中起到關(guān)鍵作用［7-8］。腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要機(jī)制就是肌成纖維細(xì)胞(Myof)增多與活化，Myof是間質(zhì)中分泌合成Ⅳ型膠原(ColⅣ)、纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的主要細(xì)胞，而ECM的過(guò)度積聚是RIF發(fā)生的主要病理改變，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞除了由成纖維細(xì)胞活化而來(lái)，還有約36%的新增纖維細(xì)胞來(lái)源于腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［9］。正常的腎小管上皮細(xì)胞具有旺盛的代謝活性和潛在的生殖能力，并能分泌多種細(xì)胞因子，在糖尿病腎病狀態(tài)下，由于腎小管和尿液經(jīng)常接觸，尿液中的尿糖、蛋白、細(xì)胞因子等有害物質(zhì)可直接引起腎小管上皮細(xì)胞損傷、活化及表型轉(zhuǎn)化。EMT的發(fā)生包括4個(gè)關(guān)鍵步驟［10］：1)腎小管上皮細(xì)胞間黏附丟失，即E-cadherin減少；2)α-SMA的表達(dá)增多；3)腎小管基底膜的破壞；4)細(xì)胞的移動(dòng)和浸潤(rùn)增加。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是目前公認(rèn)的最重要的促纖維化細(xì)胞因子，它通過(guò)刺激相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生 ECM，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生［11］。TGF-β1誘導(dǎo)的EMT最早期改變就是抑制E-cadherin的表達(dá)，E-cadherin表達(dá)減少則上皮細(xì)胞細(xì)胞間的極性和完整性遭到破壞［12］。受損的腎小管上皮細(xì)胞又可以分泌TGF-β1，刺激腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并獲得肌成纖維細(xì)胞的表型—α-SMA［13-14］。故 E-cadherin、α-SMA 及 TGF-β1被認(rèn)為是反映腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和腎間質(zhì)纖維化程度的重要指標(biāo)。

本研究采用STZ誘導(dǎo)的Wistar糖尿病腎病大鼠作為模型，采用高糖高脂飼料配合低劑量腹腔注射STZ(30 mg/kg)的方法進(jìn)行造模，模擬2型糖尿病患者的發(fā)病方式。該造模方法具有簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好、接近2型糖尿病患者的發(fā)病原因等特點(diǎn)［15］。實(shí)驗(yàn)表明，STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠體質(zhì)量、血糖、糖化血紅蛋白、24小時(shí)尿蛋白定量均較正常對(duì)照組大鼠明顯升高，病理顯示腎小球肥大，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多及腎小管上皮細(xì)胞大量萎縮、空泡變性，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，故STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠具有糖尿病腎病間質(zhì)纖維化的表現(xiàn)。太靈丹各劑量組及纈沙坦組，上述改變較模型組明顯減輕(P＜0.05)，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示太靈丹具有較強(qiáng)的降糖、減少尿蛋白及保護(hù)腎功能的作用。此外，通過(guò)免疫組化檢測(cè)到STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎臟中E-cadherin表達(dá)減弱、TGF-β1及α-SMA表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎臟內(nèi)存在EMT過(guò)程。經(jīng)太靈丹及纈沙坦處理后，上述改變較模型組明顯減輕(P＜0.05)，但各治療組之間各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明太靈丹可增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，減少TGF-β1及α-SMA的表達(dá)，減緩腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程，延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，目前認(rèn)為其病機(jī)以陰虛為本、燥熱為標(biāo)；后期則氣陰兩虛，陰陽(yáng)俱衰；正氣不足，瘀血內(nèi)生。但糖尿病腎病后期患者因蛋白丟失過(guò)多，以及瘀血形成，因此正虛及瘀血表現(xiàn)得較重，而屬于邪實(shí)的血熱表現(xiàn)得不突出。太靈丹藥物組成中太子參補(bǔ)中益氣，靈芝補(bǔ)氣安神；“一味丹參，功同四物”，丹參養(yǎng)血活血，不燥不熱，與牡丹皮、赤芍共用涼血活血；桃仁、紅花活血化瘀；生黃芪，當(dāng)歸取當(dāng)歸補(bǔ)血湯之義，補(bǔ)氣以生血；熟大黃、枳實(shí)行氣降氣使補(bǔ)而不滯，甘草補(bǔ)氣解毒，調(diào)和諸藥，諸藥合用共奏益氣養(yǎng)陰，涼血活血之功。臨床用于治療早期及臨床期糖尿病腎病，有明顯的減少尿蛋白、改善腎功能的作用，安全有效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，太子參多糖可以提高血清超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛含量，保護(hù)胰腺，降低血糖，還能降低甘油三酯和膽固醇［16］；靈芝能夠減少糖尿病腎病大鼠IGF-1在DN的表達(dá)，從而保護(hù)腎臟的作用［17］；黃芪具有降血糖、下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，減輕腎臟病組織病理?yè)p害，修復(fù)腎組織結(jié)構(gòu)的作用［18］；大黃可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞因子及ECM的合成，起到抗腎間質(zhì)纖維化的作用［19-20］。

本研究結(jié)果表明，太靈丹可能是通過(guò)減緩EMT的進(jìn)展，從而保護(hù)STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠腎臟功能和組織結(jié)構(gòu)，延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展，本研究為糖尿病腎病的治療提供新思路，為糖尿病腎病臨床防治用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。