沈 偉，馬 駿，潘豪杰，鄧明明，李 翹，任文彥

(1. 浙江千麥司法鑒定中心，杭州 311121；2. 浙江省長興縣公安司法鑒定中心，浙江長興 313100；3. 浙江省公安物證鑒定中心，杭州 310009）

以STR為標(biāo)記的法醫(yī)DNA分型技術(shù), 以其自動化程度高、快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)特點[1]，而成為當(dāng)前公安機(jī)關(guān)案件偵破及鑒定科學(xué)證據(jù)系統(tǒng)中的科技利器。目前法醫(yī)DNA分型技術(shù)涉及到DNA提取與定量、PCR擴(kuò)增及電泳檢測等多個操作步驟，故對于某些急、難案件, 檢驗速度不能滿足需要。近年來，隨著生物物證DNA檢驗技術(shù)和商業(yè)化復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的發(fā)展，直接擴(kuò)增技術(shù)（簡稱直擴(kuò)技術(shù)）由于具有縮短檢驗時間[2-3]、提高靈敏度、減少操作步驟和降低污染風(fēng)險[4]等優(yōu)點，得到了國內(nèi)外法醫(yī)從業(yè)者的廣泛關(guān)注和研究運用[5-7]，現(xiàn)本文對此作綜述。

1 直擴(kuò)技術(shù)及特點

直擴(kuò)技術(shù)又稱直接PCR或免提取擴(kuò)增技術(shù)，是將樣本不經(jīng)DNA提取或其它前處理步驟而直接加入PCR反應(yīng)體系并獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的操作[8]，故其對目標(biāo)載體的選擇或更有針對性，能在保證獲得足夠模板DNA的同時，更易得到單一個體來源的DNA分型。與傳統(tǒng)方法相比，直擴(kuò)技術(shù)具有如下優(yōu)點：首先省略了DNA提取及DNA定量步驟，僅通過擴(kuò)增和檢測兩個步驟即可獲得完整的STR分型，大大縮短了DNA檢驗的時間；其次在檢驗過程中不需更換反應(yīng)管，這樣就避免了常規(guī)檢驗過程中轉(zhuǎn)移樣品或試劑可能造成的污染；另外，節(jié)約了提取試劑和相關(guān)耗材。該技術(shù)快速、準(zhǔn)確、高效，能極大地提高我國當(dāng)前DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)水平、增強(qiáng)我國公安機(jī)關(guān)應(yīng)對一些大規(guī)模災(zāi)難性事故、群體性突發(fā)事件DNA樣本檢驗的處理能力[9]。盡管目前提取DNA的方法和試劑仍在不斷改進(jìn)，但是各種方法在提取過程中的轉(zhuǎn)移和洗滌等步驟都會導(dǎo)致不同程度的DNA損失[10-12]，且還可能引入外源性的DNA污染[13]。直擴(kuò)技術(shù)通過直接把DNA載體放入PCR管中擴(kuò)增，可避免提取過程中DNA的損失，又能減少污染風(fēng)險。Swaran[14]對玻璃、塑料、陶瓷和不銹鋼四種載體上的DNA進(jìn)行直擴(kuò)和提取的比較，發(fā)現(xiàn)四種載體上的DNA經(jīng)過直擴(kuò)后得到的熒光信號均高于其對應(yīng)提取物，并且等位基因缺失的概率更小。當(dāng)前直擴(kuò)技術(shù)已在衣物[4]、血跡[14]、全血[15]、唾液[16]、毛囊[17]、指紋[18]、指甲[19]等檢材中得到了成功的應(yīng)用。

2 商業(yè)化STR擴(kuò)增試劑盒所用的直擴(kuò)技術(shù)

2.1 商業(yè)化直擴(kuò)試劑盒的應(yīng)用

目前已有的直擴(kuò)STR試劑盒，如Identi filer Direct、PowerPlex 16 HS、Typer15 Plus、PowerPlex 18D和GlobalFiler Express等，都能夠在有血紅素和其他PCR 抑制劑存在的情況下實現(xiàn)PCR擴(kuò)增，因此可以不對生物樣本進(jìn)行提取純化而直接擴(kuò)增[8]。這些直擴(kuò)試劑盒所針對的生物樣本大都是基于FTA卡提取的血細(xì)胞和口腔上皮細(xì)胞，主要用于DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)。國內(nèi)外很多學(xué)者對此類商業(yè)試劑盒的直擴(kuò)效果做了驗證和比較[20-22]。Myers[23]對IdentiFiler Direct、IdentiFiler Plus 、PowerPlex 18D三種試劑盒經(jīng)由FTA卡進(jìn)行了直擴(kuò)比較，發(fā)現(xiàn)IdentiFiler Direct和PowerPlex 18D的成功率約為96%，IdentiFiler Plus的為94%，但是有15%的分型會在某些基因座出現(xiàn)加A不完全現(xiàn)象。商業(yè)化直擴(kuò)試劑盒促使直擴(kuò)技術(shù)在國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫建設(shè)中應(yīng)用趨于廣泛[24-26]。

2.2 商業(yè)化非直擴(kuò)試劑盒中直擴(kuò)技術(shù)的應(yīng)用

目前大部分商業(yè)化試劑盒中的PCR Buffer增加了增強(qiáng)劑和抗抑制劑，可以抵抗檢材基質(zhì)上的抑制效應(yīng)，提高低濃度樣品的成功率，從而使非直擴(kuò)的商業(yè)化試劑盒進(jìn)行直擴(kuò)也有不錯的效果。劉亞舉[27]使用Identi filer Plus試劑盒對常見的案件生物檢材進(jìn)行直擴(kuò)，結(jié)果顯示用Identi filer Plus試劑盒直擴(kuò)方法簡單、快速穩(wěn)定、檢材量小，縮短了DNA檢驗時間，可在實際檢案中選用。錢水[6]對330份案件檢材進(jìn)行了PowerPlex 21試劑盒的直擴(kuò)，結(jié)果顯示污染輕的新鮮檢材均能獲得良好效果，污染重或腐敗降解檢材直擴(kuò)效果不理想。330份檢材同步用磁珠法提取后再用PowerPlex 21試劑盒擴(kuò)增檢驗，兩者檢材檢出成功率差別不明顯。Brito[28]使用GlobalFiler試劑盒對一起強(qiáng)奸案和一起兇殺案中的檢材進(jìn)行直擴(kuò)，強(qiáng)奸案的檢材檢出了受害者和嫌疑人混合的DNA分型，兇殺案則在嫌疑人的衣服上檢出了受害人的DNA分型。

3 常見生物檢材的直擴(kuò)

PCR起始步驟的95℃熱啟動也可以裂解細(xì)胞而釋放出DNA[4]，所以免提取直接擴(kuò)增受到眾多學(xué)者的研究和探索。但對于有限量或微量檢材，是否采用直擴(kuò)還是先行DNA提取需慎重，否則直擴(kuò)后，就無法再進(jìn)行其他系統(tǒng)檢驗了。

3.1 毛發(fā)直擴(kuò)

Ottens[17]對30根毛發(fā)的毛囊以NGM試劑盒進(jìn)行直接擴(kuò)增，均獲得了成功分型，其中還包括保存了5年的毛發(fā)。他還對毛發(fā)的直擴(kuò)做了優(yōu)化，指出直接擴(kuò)增省去了提取步驟，但因無法進(jìn)行DNA定量，有些毛發(fā)直擴(kuò)會因模板太濃導(dǎo)致雙肩峰或pull-up峰，而減少擴(kuò)增循環(huán)數(shù)又有加大等位基因丟失的風(fēng)險。稀釋PCR產(chǎn)物應(yīng)是一個很有效的方法，既可以減少PCR的偽峰，又不會增加等位基因丟失的可能性[29]。高波[30]比較了Power Plex21直接擴(kuò)增法與磁珠提取擴(kuò)增法用于帶毛囊毛發(fā)STR檢驗的效果，發(fā)現(xiàn)自然脫落帶毛囊的毛發(fā)直擴(kuò)檢出STR基因型的成功率為55%，磁珠提取后擴(kuò)增檢出STR基因型的成功率僅為25%，故直擴(kuò)法比磁珠提取后擴(kuò)增更適于帶毛囊毛發(fā)的STR檢驗。

3.2 血液或唾液直擴(kuò)

血液和唾液的直擴(kuò)技術(shù)已較成熟，相關(guān)文獻(xiàn)也很多，已經(jīng)證實對此類檢材直擴(kuò)方法簡單、快速、穩(wěn)定、檢材用量小，可在實際檢案中選擇使用[6,14,16,22]。Dargay[31]對煙頭、秸稈、草、樹葉、木片和七種不同類型織物上的血液和唾液進(jìn)行了Y filer Direct、Y filer Plus和PowerPlex Y23三種試劑盒的直擴(kuò)，大部分分型都獲得了成功。錢水[6]指出對于煙蒂取其海綿部分直接擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于煙紙，實驗中20枚現(xiàn)場提取的煙頭，以PowerPlex21試劑盒直擴(kuò)，15枚直接擴(kuò)增及磁珠提取后擴(kuò)增均成功分型，2枚泡過水后晾干的煙頭，剪取海綿直接擴(kuò)增只檢出性別及3～5個小片段基因座，而用磁珠提取后能成功檢出全部基因型。李林[32]使用Identi filer Direct PCR試劑盒直擴(kuò)，20份煙蒂中有2份未得到分型圖譜，分析原因可能是剪取的檢材脫落細(xì)胞含量少，故經(jīng)再次取材而檢驗成功。因此針對煙蒂唾液斑類檢材，在使用直接擴(kuò)增法時應(yīng)盡量選取嘴唇接觸或唾液斑痕明顯之處進(jìn)行剪取，也可多剪取幾處分別擴(kuò)增而相互佐證，以保證得到正確的分型結(jié)果。

3.3 肋軟骨直擴(kuò)

李林[32]使用Identi filer Direct PCR試劑盒對較為新鮮的肋軟骨直擴(kuò)，成功率100%。錢水[6]和王傳海[33]均采用PowerPlex21試劑盒對肋軟骨進(jìn)行了直擴(kuò)，成功率分別為75%和95.45%。錢水還發(fā)現(xiàn)，對于較臟、污染重的檢材，直接擴(kuò)增往往分型失敗，而磁珠提取后擴(kuò)增可成功檢出全部基因型[6]。王傳海則認(rèn)為，磁珠法和直擴(kuò)法成功率完全一致，直擴(kuò)法檢驗未得到STR分型的檢材，采用磁珠法提取DNA后擴(kuò)增檢驗也未得到STR分型，另外取材應(yīng)盡量選取中間部位以提高直擴(kuò)成功率[33]。

3.4 衣物上的DNA直擴(kuò)

Linacre[4]等通過以2男1女為志愿者對各種類型的布料進(jìn)行接觸模擬實驗，證實直擴(kuò)法比提取法能得到更多的等位基因和更高的峰值。楊電[34]通過比較擦拭直擴(kuò)法和粘取磁珠法檢測衣物脫落細(xì)胞DNA，使用PowerPlex21試劑盒擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)兩種方法獲得的衣物接觸DNA的STR圖譜在成功率、峰型、峰高和均衡性方面都無明顯差別，但直擴(kuò)法可使實驗步驟簡化、縮短檢驗時間、降低檢驗成本，同時還可節(jié)約檢材、方便復(fù)檢。李長征等[35]直接剪取10件上衣和10只手套上可能含有脫落細(xì)胞的部位，采用Identi filer Direct PCR試劑盒擴(kuò)增，結(jié)果顯示直接擴(kuò)增法成功率明顯高于常規(guī)Chelex提取后擴(kuò)增的方法，有7件上衣和9只手套通過直擴(kuò)獲得了全部基因型。

4 接觸DNA類生物檢材的直擴(kuò)

4.1 接觸類細(xì)胞DNA的直擴(kuò)

一個人大約每天要脫落40萬個上皮細(xì)胞，這構(gòu)成了接觸DNA的主要來源[36]。在采集接觸性細(xì)胞DNA時，棉簽類型、擦拭試劑和處理方法都會對DNA檢驗產(chǎn)生影響。對于接觸性細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)移，目前大多數(shù)實驗室采用的是無菌棉簽蘸去離子水擦拭載體。 Templeton[7]通過直擴(kuò)對三種不同類型的拭子在采集和釋放DNA方面的效果做了比較，發(fā)現(xiàn)意大利COPAN公司生產(chǎn)的植絨拭子效果最好；另外他還用植絨拭子蘸取 Triton X-100對34個正常人的170個指紋進(jìn)行擦拭后做直擴(kuò)，有71%指紋得到有效分型。利用這種方法，他們幫助南澳大利亞警察從毒品包裝的膠帶指痕上通過直擴(kuò)得到了31個主要等位基因和10個次要等位基因的混合分型[18]。Thomasma[37]使用棉簽蘸取六種不同的試劑后擦拭指紋進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)蘸水擦拭得到的DNA量最低，而用SDS和 Triton X-100能夠顯著增加DNA的量，概因這些試劑具有比水更容易溶解膜蛋白和脂類的能力，故能夠獲得更多的DNA。Triton X不但有助于細(xì)胞裂解，并且由于其高黏度，還可防止DNA粘附在PCR反應(yīng)管壁上而對擴(kuò)增效率產(chǎn)生影響[38]。

4.2 接觸性游離DNA的直擴(kuò)

近年來，游離DNA也逐漸引起了國內(nèi)外法醫(yī)工作者的關(guān)注和研究。游離DNA (cell-free DNA，cfDNA)，又稱為細(xì)胞外DNA，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分布于人血漿和尿液等其他體液中[39]。目前，cfDNA被臨床廣泛研究而成為多種疾病無創(chuàng)診療監(jiān)測及預(yù)后評估的重要分子標(biāo)志物，但在法醫(yī)學(xué)的研究與應(yīng)用罕有報道。cfDNA主要來源于凋亡和壞死細(xì)胞，與細(xì)胞核DNA序列一致，提取后可增加基因組DNA的量從而能完善DNA分型，在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)有較大的潛在應(yīng)用價值。游離DNA也是接觸DNA的來源之一[40]。

Kita等[41]研究認(rèn)為在人體皮膚表面存在少量的游離DNA，能通過觸摸轉(zhuǎn)移到客體表面。Quinones[42]研究發(fā)現(xiàn)在80%的健康人汗液中存在有游離DNA，平均每毫升汗液中存在約11.5ng的游離DNA，所以要想提高接觸類DNA的檢驗成功率，就必須把游離DNA與細(xì)胞核DNA一樣用于DNA分型檢測中。Vandewoestyne[43]通過對包括血液、唾液、衣服和嘔吐物等檢材做研究，均發(fā)現(xiàn)了游離DNA的存在。他指出在對接觸類、斑痕類檢材分型時，作為重要組成部分的cfDNA卻往往被丟棄，如采用Chelex-100法提取DNA過程中含有cfDNA的檢材浸液在離心后被棄掉，這就意味著一些潛在的DNA樣品及其信息被同時丟棄了。郝曉明[44]等對人體尿液、唾液、血液3種生物檢材中的游離DNA進(jìn)行磁珠直接吸附法提取檢驗，在3種檢材中均檢出了游離DNA，總分型成功率達(dá)72%。董會[45]的研究表明在常規(guī)微量接觸類檢材和口腔拭子中，DNA大部分仍存在于細(xì)胞內(nèi)，游離DNA的量相對較少。但在微量接觸類檢材中，游離DNA量雖少，卻依然可達(dá)細(xì)胞內(nèi)DNA量10%以上的比例，游離DNA獲得的等位基因數(shù)可占總DNA獲得等位基因數(shù)的30%以上。有些收集脫落細(xì)胞的方法，比如真空吸附等，會將游離DNA排除在外，導(dǎo)致提取到的接觸DNA減少，從而降低檢驗成功率[40]。所以，改變提取方法以有效利用游離DNA將可提高PCR中DNA模板的量[41]。顯然，直擴(kuò)法可有效利用這種游離DNA，從而提高PCR成功率[4,38]。

5 快速PCR技術(shù)和直擴(kuò)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

通過調(diào)整改進(jìn)快速DNA聚合酶、熱循環(huán)儀、擴(kuò)增參數(shù)等條件可使直擴(kuò)技術(shù)更快速。近年來部分商品化擴(kuò)增試劑盒在擴(kuò)增時間上較以往試劑盒明顯縮短，如GlobalFiler Express試劑盒可40 min內(nèi)完成擴(kuò)增，而GlobalFiler試劑盒則需80 min。Verheij[46]使用PIKO熱循環(huán)儀和 Phusion Flash聚合酶通過SGM Plus, IdentiFiler, SE filer, NGM四種試劑盒進(jìn)行快速直擴(kuò)，成功將血液、唾液、精液等檢材的直擴(kuò)時間縮短至47 min。Chen等[47]報道了一種基于鐵絲的樣本快速直擴(kuò)方法，選用直徑0.5 mm的無銹單股鐵絲加熱后插入到凝血塊或其他人體組織中約5 mm, 轉(zhuǎn)動5 s后取出即放入異丙醇中固定, 隨后就直接放入PCR 反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。這種方法可在案件現(xiàn)場簡單快速地處理樣本, 不僅可節(jié)省提取DNA的時間,還可達(dá)到長期保存樣本的目的。Aboud[48]通過優(yōu)化組合擴(kuò)增儀、酶和緩沖液等條件，使對7個基因座的快速直接擴(kuò)增縮短至16 min，樣品的分型一致性達(dá)99.5%。劉琳[49]等聯(lián)合運用Identi filer Plus試劑盒與TaKaRa快速PCR檢測試劑構(gòu)建快速直接PCR體系，以FTA血卡為模板材料，采用優(yōu)化后的擴(kuò)增程序在快速PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增, 所得STR分型結(jié)果與常規(guī)方法一致，擴(kuò)增用時由常規(guī)直擴(kuò)所需的175 min減至55 min。

6 直擴(kuò)技術(shù)的影響因素

6.1 污染物

前述錢水[6]有對污染程度及檢材情況對直擴(kuò)影響的研究。另焦志[50]發(fā)現(xiàn)，在檢材表面相對較潔凈的情況下，直擴(kuò)法相比M48法提取效果更好。

6.2 檢材大小

相關(guān)文獻(xiàn)取材大小一般集中于1.2、1.5或2 mm2范圍之間[4,19]。焦志[50]證實，使用EZtape粘取法粘取手套類檢材，由于粘膜表面粘取的雜質(zhì)較多，且粘膜載體較大，加之粘膜性狀也比較特殊，而直接擴(kuò)增法體系又相對較小，故檢材大小、表面潔凈程度都會影響到后續(xù)的直接擴(kuò)增，所以對于這類檢材直接擴(kuò)增效果沒有M48提取純化效果好。因此轉(zhuǎn)移范圍要結(jié)合個人經(jīng)驗適度把握，轉(zhuǎn)移范圍過大，PCR抑制物多，部分樣本會出現(xiàn)峰值前高后低現(xiàn)象，峰型不均衡或出峰不全等問題，從而既影響對圖譜的觀察，又可能出現(xiàn)污染或混合數(shù)據(jù)；但轉(zhuǎn)移范圍過小則可能會因收集的細(xì)胞過少而檢測不出。

6.3 抑制劑

一般情況下，大部分試劑盒在血紅素、尿素、腐殖酸、色素、金屬離子等抑制劑存在的情況下仍可成功擴(kuò)增DNA，但牛仔布料上的一種靛藍(lán)胭脂紅染料會很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗[51]。王傳海發(fā)現(xiàn)對于肋軟骨來說，為減少抑制劑的影響，取材時宜盡量選取中間部位，此外還可選擇25μL擴(kuò)增體系以降低抑制劑的濃度[33]。再者，試劑中若加入了抗抑制的物質(zhì)，其與抑制物結(jié)合，雖不會影響PCR擴(kuò)增，但卻會減短毛細(xì)管的壽命。

7 直擴(kuò)技術(shù)的局限與展望

與傳統(tǒng)的分型方法相比, 直擴(kuò)技術(shù)在很大程度上節(jié)省了人力、物力、財力及時間，但其在實際案件檢驗中的應(yīng)用仍有待推廣。目前對直擴(kuò)技術(shù)的研究也大多集中于一些對前科人員的建庫，雖常規(guī)案件檢材和模擬案件檢材也有涉及。在微量DNA檢材越來越多的形勢下，直擴(kuò)技術(shù)中的很多問題需要進(jìn)一步研究解決，比如擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增程序的優(yōu)化、檢材的有效采集、擴(kuò)增中的抑制物干擾、分型結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性、檢材的一次性使用消耗等。目前，市面上專門針對檢案設(shè)計的直擴(kuò)試劑盒還較少，而且對不同類型的檢材直擴(kuò)效果也不一樣。將來隨著DNA分型技術(shù)和相關(guān)研究的不斷發(fā)展深入，以及使用更加優(yōu)化的商品化直擴(kuò)試劑盒進(jìn)行多部位選取檢材、平行擴(kuò)增等改進(jìn)措施，檢驗和分析結(jié)果的可靠性將會更有保證，出現(xiàn)混合分型的幾率也會大大降低，這或許會給廣大技術(shù)人員提供一種更加普遍適用的檢驗思路和模式，助推DNA檢驗在案件偵破中發(fā)揮更高效快捷的作用。