張 紅,賈麗欣,袁瑜璟,張 迪,金藝鵬,林德貴

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193;2.海南大學 熱帶農林學院,海南 ?？?570228)

犬乳腺腫瘤是未絕育母犬最常見的腫瘤,據報道發(fā)病率約為200/100,000犬/年[1-2]。由于我國寵物主人對犬絕育的意識較差,導致發(fā)病率可能遠高于這個比例。患犬可能有一個或多個乳腺腫瘤,研究發(fā)現(xiàn)約50%乳腺腫瘤為惡性腫瘤[3]。腫瘤的直徑大于1 cm,腫瘤的轉移已經發(fā)生,手術切除更加容易誘發(fā)腫瘤的復發(fā)和轉移[4-5]。常規(guī)的化療藥物對乳腺腫瘤的效果有限,且會造成動物的免疫抑制和其他不良反應,故需要開發(fā)更佳的治療方案來治療腫瘤病例。

多項研究發(fā)現(xiàn),某些厭氧或兼性厭氧細菌能夠在腫瘤的缺氧環(huán)境定植和增殖,通過調節(jié)機體的免疫反應和爭奪營養(yǎng)等方面發(fā)揮抗腫瘤的作用[6-7]。奇異變形桿菌是革蘭陰性腸桿菌,屬兼性厭氧菌,泌尿道的條件致病菌。我們研究發(fā)現(xiàn),奇異變形桿菌(ATCC 35659)能夠在犬乳腺腫瘤異種移植小鼠模型的腫瘤內聚集增殖,抑制腫瘤的生長,抑制肺臟轉移的發(fā)生,可能通過調節(jié)機體的局部免疫反應發(fā)揮這種治療效果。

1 試驗和方法材料

1.1 荷瘤小鼠模型的制備 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(Gibco)CMT-7364犬乳腺腫瘤細胞系,腫瘤細胞達到80% ～90%融合時,胰蛋白酶消化細胞,重懸。將107個CMT-7364犬乳腺腫瘤細胞注射至5月齡雌性BABL/c小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)的左側乳房墊內,每周進行觀察。

1.2 奇異變形桿菌的準備 奇異變形桿菌(ATCC 35659)由中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院藥理系饋贈。使用LB肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)奇異變形桿菌,使其達到對數(shù)生長期,37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h,計數(shù)細菌單菌落形成單位(CFU),以備后期使用。

1.3 細菌在小鼠體內生物分布的觀察 小鼠的乳腺腫瘤直徑達到5～8 mm時,隨機分為兩組,細菌治療組(BAC)和試驗對照組(CON),每組5只小鼠。細菌治療組尾靜脈注射奇異變形桿菌,劑量為5×106CFU/只;試驗對照組尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。于注射后的0 h、24 h和96 h觀察小鼠腫瘤的大體變化,在無菌條件下取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腫瘤組織研磨后LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌,37℃培養(yǎng)24 h后,進行細菌CFU計數(shù)。

1.4 異種移植腫瘤的生長情況評估 小鼠的乳腺腫瘤直徑達到5～8 mm時,隨機分為兩組,細菌治療組(BAC)和試驗對照組(CON),每組6只小鼠。細菌治療組尾靜脈注射奇異變形桿菌,劑量為5×106CFU/只,試驗對照組尾靜脈注射 PBS,每周1次,一共3次。每隔3 d,使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長和寬,稱量小鼠的體重。每周觀察小鼠的飲水、飲食、精神狀態(tài)和身體情況,如發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)跛行、極度萎靡或惡病質,脫頸處死小鼠,并記錄。21 d治療結束后脫頸處死小鼠,取小鼠的腫瘤稱重,取心臟、肝臟、脾臟和腎臟用福爾馬林固定,制備病理組織切片,觀察各個器官是否發(fā)生病理變化。用福爾馬林固定小鼠的腫瘤,脫水,包埋后,進行Ki-67(購自北京中杉金橋生物技術有限公司),免疫組織化學染色,以評估腫瘤細胞的增殖情況。

1.5自發(fā)性肺臟轉移情況的評估 21 d治療結束的小鼠脫頸處死后,取完整的肺臟于福爾馬林中固定24 h后,取出計數(shù)肺臟表面自發(fā)性轉移灶的數(shù)量。制備病理組織切片,對隨機選取的5個視野拍照,Image Plus Pro軟件分析肺臟的轉移面積。

1.6 ELISA檢測 小鼠異種移植的乳腺腫瘤直徑達到5～8 mm時,尾靜脈注射奇異變形桿菌,劑量為5×106CFU/只。細菌注射后24 h和96 h,眼球放血處死小鼠,采集對照組和細菌治療組小鼠的血清和腫瘤,腫瘤組織研磨后,進行TNF-α和IL-6細胞因子的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)(購自Abcam公司)。

1.7 統(tǒng)計學分析 上述獲得的數(shù)據,以平均值±標準差或平均值±標準誤來表示。使用GraphPad Prime 5采用單因素方差分析進行數(shù)據統(tǒng)計學分析和制圖,以P＜0.05為差異顯著水平。

2 結果

2.1 細菌能在小鼠異種移植的腫瘤內聚集 恒溫箱培養(yǎng)組織研磨液發(fā)現(xiàn)細菌能在腫瘤和其他器官被檢測到。心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的細菌數(shù)量隨時間增加而降低,腫瘤的細菌含量隨著時間增加而增加,說明細菌能夠在小鼠異種移植的腫瘤內特異性地生長和聚集(見中插彩版圖1A)。奇異變形桿菌治療后的24 h和96 h后大體觀察發(fā)現(xiàn)異種移植的腫瘤發(fā)生潰瘍(見中插彩版圖1B)。腫瘤病理組織學H.E.染色切片顯示尾靜脈注射細菌后腫瘤細胞發(fā)生了死亡和炎性細胞浸潤(見中插彩版圖1C)。

2.2 細菌抑制腫瘤的生長 根據公式V=a×b2/2(a代表腫瘤的長,b代表腫瘤的寬),計算小鼠異種移植腫瘤的體積,結果顯示,細菌治療組與對照組相比腫瘤體積較小,統(tǒng)計學上差異顯著;細菌注射后腫瘤質量顯著減輕;免疫組織化學結果顯示,細菌治療后腫瘤細胞的Ki-67表達降低,統(tǒng)計學上差異顯著(見中插彩版圖2)。上述結果表明,奇異變形桿菌治療能夠顯著地抑制小鼠腫瘤的生長。治療初期細菌治療組的小鼠體重減輕,但治療后期體重恢復,兩組之間沒有顯著性差異(見中插彩版圖2F),說明細菌治療在一定程度來說是安全的。

2.3 細菌抑制肺臟自發(fā)性轉移 21 d治療結束后,計數(shù)肺臟自發(fā)性轉移灶的數(shù)量發(fā)現(xiàn)細菌治療能夠顯著地抑制肺臟自發(fā)性轉移灶的形成。分析肺臟轉移面積的結果表明,細菌治療后肺臟轉移面積顯著減少(見中插彩版圖3)。上述結果表明,細菌能夠抑制肺臟的自發(fā)性轉移。

2.4 細菌調節(jié)腫瘤局部免疫反應 ELISA檢測的結果發(fā)現(xiàn),細菌注射24 h和96 h后血清中IL-6的表達沒有明顯改變;24 h后腫瘤研磨液的IL-6表達明顯升高(P＜0.05)。細菌注射后24 h和96 h后血清的TNF-α表達沒有明顯改變;細菌注射24 h后腫瘤TNF-α的表達明顯升高(P＜0.05)(見圖4)。上述結果說明細菌治療后可能調節(jié)腫瘤局部的免疫反應來發(fā)揮抑制腫瘤生長和肺臟轉移的作用。

3 展望與小結

圖4 細菌處理后小鼠血清和腫瘤中IL-6和TNF-α的表達

細菌治療是個危險的嘗試,但我們的研究過程中沒有發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌對機體造成嚴重的危害。奇異變形桿菌是條件致病菌,對多種抗生素敏感,如氟喹諾酮類、呋喃妥因、磷霉素、亞胺培南和阿米卡星,能夠很好地控制腫瘤治療過程中出現(xiàn)的副反應[8]。故奇異變形桿菌有望安全地應用于腫瘤臨床的治療或作為載體轉運治療性基因或藥物。但臨床應用前仍需要對其進行基因改造或其他減毒的措施來保障對機體絕對沒有危害。

細菌能發(fā)揮治療腫瘤的作用有多種機制,其中包括免疫調節(jié)。有研究表明,細菌治療能夠調節(jié)血清和腫瘤中TNF-α、IL-6和IL-12等細胞因子的表達來對抗腫瘤[9]。我們的結果沒有發(fā)現(xiàn),血清中這些細胞因子的表達升高,但發(fā)現(xiàn)細菌治療24 h后腫瘤研磨液中的TNF-α和IL-6表達顯著升高。這說明奇異變形桿菌可能只是引起局部的免疫反應來發(fā)揮抗腫瘤和抗轉移的作用。

以上結果表明,奇異變形桿菌可能通過調節(jié)腫瘤局部的免疫反應發(fā)揮對小鼠異種移植腫瘤的生長和肺臟轉移的抑制作用。