周海柱,郭 瑋,王東印,高云航,徐 博,滕戰(zhàn)偉,陶大鵬,勾長(zhǎng)龍,婁玉杰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.吉林省科技創(chuàng)新平臺(tái)管理中心,吉林 長(zhǎng)春 130012)

鵝為我國(guó)的傳統(tǒng)家禽,其具有抗逆性強(qiáng)、養(yǎng)殖成本低、收益高的特點(diǎn)。鵝能夠采食纖維是因?yàn)槠渚哂邪l(fā)達(dá)的盲腸,且盲腸中含大量的微生物,微生物能夠?qū)⒗w維進(jìn)行發(fā)酵降解供宿主和自身利用。研究表明,鵝盲腸的環(huán)境溫度和pH值適宜,適合微生物生存,正是由于這些微生物酶解作用將纖維素分解[1-2]。腸道微生物和宿主之間的關(guān)系是科研工作者的關(guān)注熱點(diǎn)。李彥品研究指出,2.5%低纖維飼糧降低了仔鵝的蛋白和能量的利用率,降低了盲腸微生物的多樣性[3]。腸道微生物對(duì)致病菌的繁殖具有抑制作用,定植在腸黏膜上的微生物能夠防止病原微生物和毒物進(jìn)入體內(nèi),起到了屏障作用[4]。目前,對(duì)鵝腸道黏膜定植菌種類的研究尚未形成一定的系統(tǒng),關(guān)于纖維對(duì)鵝腸道黏膜定植菌的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同水平及來(lái)源的纖維對(duì)鵝免疫性能、腸道黏膜定植菌的影響,為揭示鵝腸道黏膜細(xì)菌定植規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取體重均勻、健康的5周齡的吉林白鵝80只,隨機(jī)分為4個(gè)試驗(yàn)組,每組20只。分組見(jiàn)表1。

1.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)鵝在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖基地進(jìn)行飼養(yǎng),每天早晚各飼喂一次,嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境,按照正常的飼養(yǎng)管理和免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)。試驗(yàn)期為35 d。

1.3 試驗(yàn)日糧組成與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 依據(jù)等能、等蛋白原則,參照NRC(1994)和我國(guó)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表(2007)配制。日糧配方見(jiàn)表1。

表1 日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分 /%

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 免疫器官指數(shù) 飼養(yǎng)結(jié)束后,每個(gè)處理隨機(jī)選取5只鵝進(jìn)行試驗(yàn),稱重后屠宰。取出胸腺、腔上囊、脾臟,去除附屬組織后進(jìn)行稱重并計(jì)算器官指數(shù)。計(jì)算公式如下：

1.4.2 腸道黏膜采集測(cè)定 屠宰后,對(duì)十二指腸、空腸、回腸、盲腸進(jìn)行結(jié)扎,酒精擦拭消毒后在無(wú)菌超凈臺(tái)將腸段剪開(kāi),生理鹽水沖洗,用滅菌手術(shù)刀片刮取腸道黏膜,存入2 mL凍存管,液氮快速冷凍后,置于-80℃冰箱中待檢。采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)鵝腸道黏膜定植菌進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行初步整理,采用SPSS 18.0進(jìn)行多重比較分析,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧纖維對(duì)吉林白鵝免疫器官指數(shù)的影響由表2可知,隨著日糧纖維水平的提高,II組和IV組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均比I組和III組顯著提高(P＜0.05);腔上囊指數(shù)有提升趨勢(shì),但差異不顯著(P＞0.05)

在相同纖維水平的條件下,II組和IV組的胸腺指數(shù)分別為0.32%、0.23%,差異性顯著(P＜0.05)。其余各組均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表2 免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果 /%

2.2 腸道黏膜PCR-DGGE指紋圖譜和微生物多樣性分析 由圖1可知,各組各腸段腸黏膜定植微生物的含量和多樣性。通過(guò)表3及圖2可知,隨纖維水平升高,各腸段黏膜定植菌的豐度、多樣性指數(shù)也隨之上升;在同一纖維水平下,I組微生物豐度、多樣性指數(shù)要小于III組,II組微生物豐度小于IV;各組各腸段黏膜定植菌種類均勻。

圖1 腸道黏膜定植微生物PCR-DGGE指紋圖譜

圖2 腸道黏膜PCR-DGGE電泳豐度

由表4可知,I組和II組回腸相似性指數(shù)為35.6%,相似性最小,表明I組和II組間的回腸微生物差異性最大,纖維水平的提高,對(duì)回腸黏膜微生物的多樣性具有較大影響;III組和IV組相比,其十二指腸微生物相似性指數(shù)最小,表明兩組間十二指腸黏膜微生物差異性最大,日糧纖維水平對(duì)十二指腸黏膜定植菌群多樣性影響最大。

在同一日糧纖維水平下,I組與III組相比,回腸黏膜相似性指數(shù)為50.4%;II組和IV組相比,回腸黏膜相似性指數(shù)為46.5%。

表3 腸道黏膜微生物豐度、多樣性指數(shù)和均勻度

表4 I、II、III、IV組各腸段黏膜微生物相似性指數(shù)分析 /%

2.3 腸道黏膜PCR-DGGE指紋圖譜的聚類分析

圖3 吉林白鵝腸道黏膜PCR-DGGE指紋圖譜聚類分析

從圖3可以看出,I各組各腸段黏膜之間微生相似程度均較低,各樣品之間的菌群差異性較大,但仍有共同菌,并且不同來(lái)源及不同水平的纖維對(duì)各腸段黏膜定植微生物結(jié)構(gòu)變化具有一定的影響。

2.4 腸道黏膜PCR-DGGE指紋圖譜差異性條帶與共性條帶測(cè)序結(jié)果分析 依據(jù)腸道黏膜PCR-DGGE指紋圖譜,將差異性條帶、共性條帶共16個(gè)進(jìn)行切膠回收。對(duì)回收的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序,用GenBank對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見(jiàn)表5,其中相似度達(dá)到99%以上的條帶有9個(gè),達(dá)到98%以上的條帶有2個(gè)。幽門螺桿菌(Helicobacter cetorum)和大腸桿菌(MC)廣泛的寄存在各腸段黏膜中,戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)主要寄存在回腸黏膜,Peptoclostridium difficile、梭狀芽孢桿菌(DSM)主要寄存空腸、回腸、盲腸黏膜中,核酸桿菌主要存在于回腸、盲腸黏膜中,瘤胃球菌屬(Ruminococcus obeum)主要存在于盲腸黏膜中,空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)廣泛存在于回腸黏膜中。

表5 腸道黏膜PCR-DGGE指紋圖譜差異性條帶與共性條帶測(cè)序結(jié)果

3 討論

3.1 日糧纖維對(duì)吉林白鵝免疫器官指數(shù)的影響 隨著日糧纖維水平的提高,鵝脾臟、胸腺及腔上囊等免疫器官指數(shù)均顯著的升高[5]。本試驗(yàn)表明,隨著日糧纖維水平的提高,I組與II組、III組與IV組之間的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)增加,差異顯著,說(shuō)明日糧適宜的纖維水平能夠提高鵝機(jī)體免疫力。胡敏華[6]等研究肉鵝日糧不同的纖維水平(5.03% ～10.98%)對(duì)免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)各處理組間脾臟指數(shù)差異顯著,且纖維水平為6.97%時(shí)達(dá)最高值,日糧中適量的添加纖維可以提高肉鵝的免疫功能,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 日糧纖維對(duì)吉林白鵝腸道黏膜微生物多樣性的影響 腸道內(nèi)的微生物對(duì)鵝的營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫功能至關(guān)重要。日糧組成能夠影響腸道中微生物分布與數(shù)量的變化[7-8]。日糧纖維可以改變鵝腸道黏膜菌群的多樣性和豐度且不同腸段菌群結(jié)構(gòu)變化不同[5]。本試驗(yàn)研究表明,提高日糧的纖維水平,各腸段黏膜的微生物的含量及其多樣性指數(shù)也隨之升高;同一纖維水平,秸稈組各腸段黏膜定植菌群豐度和多樣性與苜蓿組相比較低。通過(guò)比較相似性指數(shù)可以看出,秸稈處理組回腸黏膜相似性指數(shù)最小,苜蓿處理組十二指腸相似度最小,表明纖維水平的不同對(duì)秸稈組的回腸及苜蓿組的十二指腸黏膜菌群結(jié)構(gòu)影響最大。在相同纖維水平下,各組回腸黏膜相似性指數(shù)最小,證明飼喂苜蓿對(duì)于提高回腸黏膜微生物多樣性影響最大。聚類分析表明不同腸段之間相似度均較低,樣品間的差異性較大,但仍存在共同菌。

代文婷[9]研究表明,在牛瘤胃壁上附著的菌群中有22.4%為擬桿菌屬,11%為瘤胃球菌屬,脫硫桿菌屬占4%。Sadet[10]等研究發(fā)現(xiàn),羊瘤胃壁黏膜粘附菌其中就有擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)。

本試驗(yàn)通過(guò)克隆測(cè)序研究發(fā)現(xiàn),各腸段黏膜中廣泛的寄存著幽門螺桿菌(Helicobacter cetorum)、大腸桿菌(Escherichia coli),能夠分解腸道中纖維素的瘤胃球菌屬(Ruminococcus obeum)廣泛定植于盲腸黏膜,而梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)為纖維素分解菌的一種,其定植于空腸、回腸、盲腸黏膜,戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)能夠分解碳水化合物主要定植于回腸黏膜。日糧纖維水平的不同能夠?qū)α鑫盖蚓鷮?、梭狀芽孢桿菌屬、戊糖片球菌屬定植數(shù)量產(chǎn)生影響,與羅旭[11]研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

4.1 隨著日糧纖維水平的提高,吉林白鵝胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著增加,腔上囊指數(shù)有增長(zhǎng)趨勢(shì)。

4.2 隨日糧纖維水平的提高,吉林白鵝十二指腸、空腸、回腸、盲腸黏膜定植微生物多樣性提高,其中優(yōu)勢(shì)菌瘤胃球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、戊糖片球菌數(shù)量增加,對(duì)纖維有分解能力的菌群出現(xiàn)了不同程度的增加。