李 偉，許學(xué)芬

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，南京 210023)

前列腺癌作為男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家的發(fā)病率遠高于亞洲國家[1-2]。但近年來，隨著經(jīng)濟水平的不斷提高，人口老齡化進一步明顯，亞洲國家的前列腺癌發(fā)病率也明顯增加[3]。前列腺是雄激素依賴性器官，早期治療主要依賴于手術(shù)治療及局部放療[1]。但事實上，由于早期前列腺癌發(fā)病隱匿，在我國發(fā)現(xiàn)前列腺癌時往往已經(jīng)到達中晚期[4]。因此針對我國中晚期前列腺癌的病情，常用治療手段是雄激素撤除治療[5]。但是隨著治療進程推進，大部分患者最終會發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌，治療效果不佳，最終腫瘤細胞轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡[4]。因此迫切需要尋找有效的前列腺癌治療方法或抗腫瘤效果確切但不良反應(yīng)較小的藥物。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄屬植物中，目前已在70多種植物中被發(fā)現(xiàn)[6]。近年來對白藜蘆醇研究發(fā)現(xiàn)，該藥能誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡且副作用小，因而成為近年來研究的熱點[7]。研究表明，白藜蘆醇對肺癌[8]、乳腺癌[9]等多種腫瘤細胞均有很好的增殖抑制作用，但是對前列腺癌作用的研究較少。本實驗以人前列腺癌DU145細胞為研究對象探討白藜蘆醇誘導(dǎo)其凋亡的分子機制，從而為前列腺癌的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

白藜蘆醇(美國Sigma公司)；人前列腺癌細胞系DU145(中國科學(xué)院上海細胞庫)；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；青霉素、鏈霉素(華北制藥公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、JC-1檢測試劑盒(南京凱基生物科技公司)；兔抗人Cyclin A抗體、兔抗人Cyclin D1抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人p27抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人caspase-3抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人caspase-8抗體、兔抗人caspase-9抗體、兔抗人Cytc抗體、兔抗人AIF抗體、兔抗人Histone抗體、兔抗人COX-IV抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人β-actin抗體(美國Sigma公司)

1.2 儀 器

3111型CO2細胞培養(yǎng)箱、Varioskan flash型酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；Epics elite-Esp型流式細胞儀(美國Beckman Counter公司)；UV Transil luminator型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、垂直電泳槽、DYY-6C型電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

用含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)以適量濃度接種在培養(yǎng)瓶中的人前列腺癌DU145細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。細胞呈貼壁生長。每2～3天傳代1次。細胞呈單層貼壁生長，選對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法

將處于對數(shù)生長期的DU145細胞用0.02% EDTA消化，制成細胞懸液，以每毫升2×105的細胞濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100 μL，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，在每孔中分別加入濃度倍比稀釋的白藜蘆醇100 μL，孵育24 h，再在每孔中加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的四甲基偶氮唑溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，在每孔加入二甲亞砜(DMSO)100 μL，置于微型振蕩器上震蕩約5 min，使結(jié)晶完全溶解，于酶聯(lián)儀波長570 nm處測定吸收度。吸收度越高，活細胞數(shù)越多。根據(jù)吸收度計算藥物對細胞的活力抑制率，并根據(jù)改進寇氏法計算出半數(shù)抑制濃度IC50。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

將正處于對數(shù)生長期的DU145細胞的細胞懸液(含1×106個細胞)接種于6孔板上，每孔2 mL，并培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度的白藜蘆醇(12.5，25和50 μmol/L)，另設(shè)對照組。24 h后，收集懸液細胞至10 mL離心管中，板中未脫壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集(胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性)。2 000 r/min離心5 min。預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次。去離子水稀釋試劑盒中的4×結(jié)合緩沖液稀釋至使用濃度，1×結(jié)合緩沖液400 μL懸浮細胞，濃度大約為每毫升1×106個細胞。取細胞懸液195 μL加入Annexin V-FITC 5 μL?；靹?，避光，室溫下染色10 min。再用PBS清洗細胞，1×結(jié)合緩沖液190 μL重懸細胞，加入PI(20 μg/mL)10 μL。避光染色20 min，用流式細胞儀檢測。

2.4 PI單染檢測細胞周期

將DU145細胞接種到6孔板上，培養(yǎng)24 h,分別加入不同濃度的白藜蘆醇(12.5，25和50 μmol/L)，另設(shè)對照組和陽性組。24 h后，收集懸液細胞至10 mL離心管中，板中未脫壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集(胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性)。2 000 r/min離心5 min。預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次。離心，棄去上清液，用70%乙醇固定20 min，用PBS清洗2～3次，加入RNA抑制劑和PI(20 μg/mL)10 μL，避光染色30 min。用流式細胞儀檢測細胞周期。

2.5 細胞內(nèi)ROS水平的檢測

分別用12.5，25，50 μmol/L的白藜蘆醇分別作用于接種于6孔板的DU145細胞24 h，同時設(shè)立空白對照組，收集細胞于1.5 mL離心管。按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為100 mmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5分鐘顛倒混勻，使探和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。用流式細胞儀器分析。

2.6 細胞內(nèi)線粒體膜電位(ΔΨm)的檢測

分別用12.5，25，50 μmol/L的白藜蘆醇分別作用于DU145細胞24 h，同時設(shè)立空白對照組，收集細胞于1.5 mL試管。按照試劑盒說明，每組加入緩沖液1 000 μL，然后加入JC-1 2 μL，混勻。在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育15～20 min。2 000 r/min離心5 min，去除上清液，用PBS清洗后，用流式細胞儀器分析。

2.7 線粒體蛋白和胞漿蛋白的分離

對數(shù)生長期的DU145細胞貼壁后至細胞密度為70%～80%，分別加入12.5，25，50 μmol/L白藜蘆醇，同時設(shè)立空白對照組。提取線粒體蛋白和胞漿蛋白前需要將5×胞漿提取液用去離子水稀釋成1×胞漿提取液，并且配成胞質(zhì)提取液(1 mL)+蛋白酶抑制劑(2 mL)+DTT(1 mL)和線粒體提取液(1 mL)+蛋白酶抑制劑(2 mL)+DTT(1 mL)。細胞孵育24 h后，4 ℃，2 400 r/min離心5 min，收集5×107個細胞。用冰PBS 10 mL洗滌細胞，然后4 ℃，2 400 r/min離心5 min，棄上清液。每組細胞沉淀中加1 mL混有DTT和蛋白酶抑制劑的1×胞漿提取液。冰上孵育10 min。將細胞置于細胞勻漿器中在冰上勻漿30～40次，在顯微鏡下觀察細胞周圍無光環(huán)即可。勻漿液轉(zhuǎn)移入1.5 mL試管中，4 ℃，2 500 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL試管中，4 ℃，10 600 r/min離心30 min。上清液即為胞漿蛋白，沉淀為線粒體。在線粒體沉淀中加入含有DTT和蛋白酶抑制劑的線粒體提取液0.1 mL，冰上裂解10 min，再渦旋10 s，即為線粒體蛋白。

2.8 Western blot檢測

細胞經(jīng)各濃度藥物處理后按照試劑盒要求提取質(zhì)蛋白和膜蛋白，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液封閉1 h，加入稀釋好的Cyclin A、Cyclin D1、p21、p27、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Cytc、AIF、COX-IV、Histone、β-actin一抗(1∶500)，4 ℃恒溫搖床孵育12 h，PBST洗膜，二抗IgG(1∶15 000)，4 ℃避光孵育1 h，再用PBST洗膜后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行檢測。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0和Excel軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗和數(shù)據(jù)處理均重復(fù)3次。

3 結(jié) 果

3.1 白藜蘆醇對DU145細胞增殖抑制作用

MTT實驗結(jié)果如下圖1所示。在白藜蘆醇作用于人前列腺癌DU145細胞約24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以顯著抑制DU145細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性。白藜蘆醇對人前列腺癌DU145細胞的作用24 h后IC50為(50.95±8.66)mol/L。確定12.5、25和50 μmol/L作為之后體外實驗中白藜蘆醇的給藥低、中、高劑量，給藥時間為24 h。

3.2 PI單染檢測白藜蘆醇對DU145細胞周期的影響

根據(jù)PI單染結(jié)果計算出細胞分布在各細胞周期的百分比柱狀圖，如圖2所示。從結(jié)果可以看出，隨著白藜蘆醇給藥濃度的增加，G0/G1期細胞比例明顯增加，S期和G2/M期細胞比例明顯減少。說明白藜蘆醇對DU145細胞的周期阻滯主要發(fā)生在G0/G1期，白藜蘆醇具有明顯的G0/G1期周期阻滯作用。

Figure2 Influence of paclitaxel treatment on cell cycle by Res Summary of the percentage of cells at G0/G1,S and G2/M phase was performed

3.3 Western blot檢測白藜蘆醇對DU145細胞周期相關(guān)蛋白表達水平的影響

如圖3所示，不同濃度的白藜蘆醇(12.5，25，50 μmol/L)作用于DU145細胞24 h后，可以發(fā)現(xiàn)，隨著給藥劑量的增加，G0/G1期周期阻滯相關(guān)蛋白Cyclin A和Cyclin D1蛋白表達逐漸減少，而細胞周期激酶相關(guān)蛋白p21和p27蛋白表達逐漸增加。免疫印跡實驗的結(jié)果表明，白藜蘆醇可以通過上調(diào)Cyclin A和Cyclin D1蛋白的表達和下調(diào)p21和p27蛋白表達使DU145細胞中阻滯在G0/G1期。

Figure3 Western blot analysis of Cyclin A,Cyclin D1,p21 and p27 of the DU145 cells treated with 12.5,25 and 50 μmol/L of Res for 24 h

3.4 Annexin V/PI雙染檢測白藜蘆醇對DU145細胞凋亡率的影響

如圖4所示，白藜蘆醇作用24 h后，凋亡細胞占比顯著升高。其中，對照組早期和晚期凋亡的細胞占比分別為2.8%和6.0%。隨著加入的白藜蘆醇劑量的升高(12.5，25，50 μmol/L)，早期和晚期凋亡的細胞數(shù)量也明顯升高。早期凋亡的細胞從對照組的2.4%分別上升到7.0%，17.7%和40.4%；晚期凋亡的細胞從4.0%分別上升到9.9%，11.0%和13.1%。實驗結(jié)果說明，白藜蘆醇對DU145細胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，且高劑量組(50 μmol/L)誘導(dǎo)凋亡的作用更明顯。

3.5 白藜蘆醇對DU145 細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

如圖5所示，不同濃度的白藜蘆醇(12.5，25，50 μmol/L)作用于DU145細胞24 h后，可以發(fā)現(xiàn)，隨著給藥劑量的增加，Bcl-2蛋白表達逐漸減少，而Bax蛋白表達逐漸增加。DU145細胞中Bax/Bcl-2的蛋白水平變化可以啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，即激活caspase-9，caspase-9接著又激活caspase-3及其他信號蛋白，從而發(fā)生誘導(dǎo)凋亡作用。因此，從圖6中還可以發(fā)現(xiàn)，DU145細胞在經(jīng)不同劑量的白藜蘆醇作用24 h后，procaspase-3的表達下降，同時caspase-3的激活形式cleaved-caspase-3表達增加，procaspase-9的表達下降，同時caspase-9的激活形式cleaved-caspase-9表達增加。

Figure5 Western blot analysis of Bcl-2,Bax,and caspase-8,-9,-3 of the DU145 cells treated with 12.5,25 and 50 μmol/L of Res for 24 h

3.6 白藜蘆醇對DU145細胞內(nèi)ROS水平的影響

線粒體是ROS的主要產(chǎn)生部位。ROS的積累會導(dǎo)致線粒體膜電位的崩解，并觸發(fā)細胞凋亡。如圖6所示，用25和50 μmol/L Res作用DU145細胞24 h后，相對于對照組，給藥后細胞內(nèi)ROS生成顯著增多，且成劑量依賴性。

3.7 白藜蘆醇對DU145細胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

JC-1是一種熒光染料，在正常細胞內(nèi)聚集在線粒體內(nèi)，形成多聚體，呈鮮紅色熒光；而在凋亡細胞內(nèi)，由于線粒體跨膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內(nèi)，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。JC-1的熒光強度可以用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm；發(fā)射波長530 nm)，綠色熒光通過FITC通道通常為FL1來檢測；紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測。實驗結(jié)果顯示，在DU145細胞中，和空白組比較，隨著白藜蘆醇劑量的增加，線粒體膜電位ΔΨm降低明顯，且有劑量依賴性。如圖7可見，12.5，25和50 μmol/L分別作用時，線粒體膜電位耗散分別為5.81%，10.74%和25.66%。

3.8 白藜蘆醇對DU145細胞AIF蛋白和Cytc釋放的影響

AIF是正常健康細胞內(nèi)的一種黃素蛋白，由于參加了線粒體能量和氧化還原反應(yīng)，所以和線粒體功能有關(guān)。在凋亡信號刺激下AIF先從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)再到細胞核，在細胞核引起染色體凝聚和DNA大片段斷裂最終導(dǎo)致細胞凋亡。白藜蘆醇處理后的DU145細胞中，發(fā)現(xiàn)AIF進入細胞核，并呈劑量依賴性。如圖8所示，隨著白藜蘆醇給藥劑量的增加，線粒體中的Cytc逐步釋放到細胞胞漿內(nèi)，激活了線粒體凋亡途徑。

Figure8 Transposition of apoptotic-inducing factor (AIF) from mitochondria to nucleus was detected.DU145 cells were treated with Res (12.5,25,and 50 μmol/L)

4 討 論

前列腺癌是中老年男性發(fā)病率較高的腫瘤之一，是引起美國男性死亡的第二大腫瘤殺手，而在我國前列腺癌發(fā)病率也在迅速增加[1-4]，由于前列腺癌的發(fā)病機制極其復(fù)雜，目前并無有效的藥物能夠根治。有研究證實，黃酮和多酚類化合物能夠很好地預(yù)防、治療前列腺癌[10-11]。白藜蘆醇是廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等藥用植物中的一種多酚類化合物，作為低毒性的天然藥物具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化等多方面作用，許多研究表明白藜蘆醇是一種很有前景的抗腫瘤藥物[12]。臨床大量研究均表明，在治療如肝癌[13]、乳腺癌[9]、肺癌[8]等多種晚期惡性腫瘤患者時，應(yīng)用化療藥物聯(lián)合白藜蘆醇臨床療效顯著。本研究結(jié)果顯示，在人前列腺癌DU145細胞中白藜蘆醇作用24 h之后，IC50為(50.95±8.66) μmol/L。白藜蘆醇可以顯著地抑制人前列腺癌DU145細胞的增殖，并呈劑量和時間依賴性。

白藜蘆醇抗腫瘤作用機制尚未完全明確，通過誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生周期阻滯是一種重要的抑制細胞增殖的作用機制。本實驗從細胞周期阻滯的角度，研究白藜蘆醇對人前列腺癌DU145細胞的增殖抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度白藜蘆醇作用下的DU145細胞經(jīng)流式細胞儀分析表明，與空白對照組相比，隨著濃度增加，G0/G1期細胞比例顯著升高。免疫印跡實驗表明，白藜蘆醇通過上調(diào)Cyclin A、CyclinD1蛋白表達水平和下調(diào)p21、p27蛋白表達水平，使DU145細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制腫瘤細胞增殖。

細胞凋亡是在多種基因調(diào)控下，指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞自主的有序的死亡，在細胞衰老、腫瘤的發(fā)生中起重要作用，細胞凋亡是一個復(fù)雜并且涉及多條通路的過程[14]。通過Annexin V-FITC/PI雙染實驗，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有誘導(dǎo)人前列腺癌DU145細胞凋亡作用，并隨著給藥濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例均顯著增加。有研究結(jié)果表明，Bax、Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)凋亡信號的關(guān)鍵蛋白[15]。并且，在許多腫瘤細胞的凋亡過程中都發(fā)現(xiàn)有caspase-3的活化，caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子[16-17]。免疫印跡實驗證明白藜蘆醇對人前列腺DU145細胞凋亡通路蛋白的作用。白藜蘆醇可以下調(diào)Bcl-2蛋白水平，上調(diào)Bax蛋白水平，激活caspase-3并引發(fā)其它Caspase蛋白級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。實驗結(jié)果表明了白藜蘆醇可以通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2蛋白水平從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)人前列腺DU145細胞發(fā)生凋亡。

細胞凋亡分為外源性和內(nèi)源性兩條通路[18-19]。白藜蘆醇作用內(nèi)源性凋亡通路，也就是線粒體依賴性凋亡通路[20]，導(dǎo)致了Cytc的釋放與caspase-3的激活。此外，ROS聚集誘導(dǎo)MMP的破壞，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，一旦MMP崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)[21]。DU145細胞在給予白藜蘆醇之后，其線粒體膜電位出現(xiàn)了明顯的破壞，提示凋亡的發(fā)生。MMP的快速降低誘導(dǎo)線粒體凋亡蛋白的釋放，引發(fā)了Caspase依賴性的細胞凋亡。此外研究還發(fā)現(xiàn)，在白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞凋亡中，細胞內(nèi)ROS的升高且呈明顯的劑量依賴性，誘導(dǎo)線粒體釋放AIF入核，產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象。AIF是一種非Caspase依賴性的死亡效應(yīng)子，當(dāng)它從線粒體膜間隙轉(zhuǎn)移到細胞核中時，會引發(fā)細胞染色質(zhì)的凝聚，磷脂酰絲氨酸的暴露，以及大規(guī)模的DNA斷裂，最終細胞死亡。

綜上所述，白藜蘆醇可以將人前列腺癌DU145細胞阻滯在G0/G1期，并誘導(dǎo)DU145細胞凋亡。主要是通過ROS-線粒體途徑，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)下游蛋白表達，從而誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生。白藜蘆醇也可以通過周期阻滯產(chǎn)生明顯的抑制細胞增殖作用，從而抑制DU145細胞的生長。然而，在整個凋亡過程的發(fā)生中，白藜蘆醇是否通過其他通路發(fā)揮抗腫瘤作用，以及更加詳細的作用機制，都需要進一步研究與探討。本研究為進一步開發(fā)白藜蘆醇成為新的抗前列腺癌用藥提供了理論基礎(chǔ)。