田介云，魏安智，劉玉林，王勝淇，劉永紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

仁用杏是以杏仁為主要食用、藥用產(chǎn)品的杏屬果樹的統(tǒng)稱，具有很高的開發(fā)利用價值和潛力，同時兼?zhèn)溥m應(yīng)性廣、抗逆性強且栽培技術(shù)較簡單等優(yōu)點，可用于改善生態(tài)環(huán)境、防止水土流失和荒漠化，從而成為重要的經(jīng)濟林樹種[1-2]。仁用杏主要分布于我國河北、遼寧、甘肅、內(nèi)蒙、山西、陜西、新疆等省(區(qū))[3]。在實際生產(chǎn)中，受到北方氣候環(huán)境的影響，易受冬季嚴寒危害，造成花芽、枝條損傷；同時又由于杏樹開花較早，在春季極易遭受晚霜危害，造成減產(chǎn)甚至絕收，因此，低溫和霜凍是制約仁用杏產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的根本因素[4]。本研究在前人有關(guān)仁用杏抗寒性研究的基礎(chǔ)上，對仁用杏抗寒性方面的研究進展進行了分析，旨在為仁用杏抗寒機制研究和抗寒育種提供參考。

1 抗寒品種的選育

仁用杏從1968年開始在河北省張家口地區(qū)大量興起并發(fā)展，隨之在實際生產(chǎn)中出現(xiàn)問題，有些主栽品種的幼樹進入結(jié)果期后常遭受凍害，產(chǎn)量和品質(zhì)均受到很大影響，因而仁用杏抗寒品種的選育工作也相應(yīng)展開[5]。

解決仁用杏免受晚霜低溫凍害的根本途徑是選育出抗寒新品種[6]。抗寒育種初期，經(jīng)過多年田間選育和觀察，選出了“優(yōu)一”、“三桿旗”、“新四號”3個抗凍害優(yōu)系[7]。針對陜北黃土丘陵區(qū)冬季寒冷干燥、全年降雨分布不均、陽光充足的大陸性季風氣候，研究人員對引進的4個仁用杏品種進行設(shè)點觀測及各生長發(fā)育指標調(diào)查，最終從中選出“優(yōu)一”、“一窩蜂”2個仁用杏品種作為陜北地區(qū)的適栽品種，并于2005年通過品種審定[3]。目前，‘圍選1號’是公認的抗晚霜仁用杏新品種，該品種是在河北圍場從龍王帽品系中選出，經(jīng)嫁接繁殖后，其性狀穩(wěn)定，抗晚霜能力明顯強于其他品種，于2007年12月通過河北省林木品種審定委員會審定[6]。

2 抗寒生理生化方面的研究

植物抗寒性是由眾多基因控制的數(shù)量性狀[8]。植物在遭受凍害時，細胞和組織中的水分會凝結(jié)而引起傷害。首先，細胞間隙中細胞壁附近的水分會結(jié)冰，引起原生質(zhì)脫水、蛋白質(zhì)變性，即胞間結(jié)冰；隨之，原生質(zhì)體和液泡在受凍后所結(jié)冰晶會使原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成不可逆的機械損傷，致使代謝發(fā)生紊亂甚至細胞死亡，即胞內(nèi)結(jié)冰[9]。細胞膜系統(tǒng)是低溫危害作用的首要部位，生物膜系形態(tài)和成分的改變，在抗寒機制上起至關(guān)重要的作用[10]。大量研究表明，低溫脅迫下植物體內(nèi)自由基和活性氧大量積累，引起膜脂過氧化和蛋白質(zhì)被破壞，這可能是植物細胞膜系統(tǒng)受損的原因之一[11]。植物體內(nèi)存在保護酶系統(tǒng)，可清除活性氧和自由基，保護酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)及抗壞血酸氧化酶(ASP)等。

針對植物抗寒性復(fù)雜的生理機制，逐漸形成了一系列表征植物抗寒能力的生理指標，從而可對植物抗寒性機理進行進一步揭示與驗證。通過對杏品種的1年生枝條進行-24～-40℃低溫脅迫處理，測定電解質(zhì)滲出率并與Logistic方程結(jié)合，可得到杏休眠枝的臨界致死溫度，為仁用杏抗凍鍛煉提供理論依據(jù)[12]。試驗表明，通過銅、鋅處理仁用杏品種龍王帽的葉、枝、干、主根、側(cè)根等各部位，可有效抑制仁用杏苗木細胞膜的脂質(zhì)過氧化作用，降低細胞膜的受損程度，使仁用杏抗寒性得到提高[4]；銅、鋅作用體為SOD酶，可使SOD活性增強而超氧自由基含量降低。在對仁用杏“優(yōu)一”、“白玉扁”、“龍王帽”3個品種的各繁殖器官自然升溫過程中相關(guān)生理指標的變化情況研究中發(fā)現(xiàn)，仁用杏半致死溫度隨著自然界溫度的升高而逐漸上升，SOD和可溶性糖含量呈“M”型變化趨勢，POD和脯氨酸含量總體下降，說明杏樹體內(nèi)一系列抗寒性相關(guān)物質(zhì)在自然條件下會隨外界溫度環(huán)境條件的變化而做出相應(yīng)調(diào)整[13]。鄭元[14]等則采用人工模擬的方式，對仁用杏品種“一窩蜂”、“優(yōu)一”和“龍王帽”進行低溫脅迫處理，得出電解質(zhì)滲出率、丙二醛(MDA)含量與仁用杏抗寒性具有相關(guān)性。仁用杏盛花期枝條上的花瓣、雄蕊、雌蕊在低溫脅迫處理后，抗寒能力大小也不同，花瓣的抗寒能力強于花蕊，而雄蕊又強于雌蕊[15]。另有研究中發(fā)現(xiàn)，在對抗寒性不同的‘圍選1號’和“龍王帽”雌蕊進行8個溫度梯度的低溫處理后，抗寒能力強的‘圍選1號’具有較高的AsA-GSH循環(huán)效率，體內(nèi)過氧化氫(H2O2)的積累被有效抑制，使其H2O2含量低于晚霜敏感型品種，這可能是‘圍選1號’抗晚霜能力較強的原因之一[16]。

3 分子生物學(xué)方面的研究

植物在低溫脅迫下產(chǎn)生的一系列生理生化反應(yīng)會誘導(dǎo)相關(guān)抗寒基因的表達。這一應(yīng)激反應(yīng)要經(jīng)過低溫信號感受、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多個相當復(fù)雜的過程[17]。C.J.Weiser[18]指出，冷馴化期間植物抗凍性的提高受到基因表達的調(diào)控，多年生木本植物適應(yīng)低溫的機制是通過轉(zhuǎn)錄激活特異基因及合成新蛋白質(zhì)。植物抗寒的分子機制目前尚不完全清楚，普遍的觀點認為植物中作為第二信使的Ca2+在前期低溫信號的感受和傳導(dǎo)中起著重要作用。在低溫脅迫下，一系列生理生化的改變會引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，經(jīng)由磷脂酶、三磷酸肌醇和磷脂酸等的信號級聯(lián)放大，激活下游抗寒轉(zhuǎn)錄因子和抗寒基因的表達。隨著分子生物技術(shù)在植物中的深入研究應(yīng)用，大量與抗寒相關(guān)的基因被分離和鑒定出來。

冷脅迫誘導(dǎo)的基因分為2類：一類是功能基因，如編碼抗凍蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)蛋白基因等；另一類是調(diào)控基因，包括轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)、編碼蛋白激酶和與磷酸肌醇代謝有關(guān)的酶基因等[19]?？箖龅鞍?Antifreeze protein,AFP)因其特有的3大特性可有效提高植物抗寒性，AFP首先在動物中發(fā)現(xiàn)，隨后才逐漸在植物中展開研究。 CBF(CRT/DRE binding factor)轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控基因，在轉(zhuǎn)錄水平上對抗寒基因表達進行調(diào)節(jié)。由冷脅迫誘導(dǎo)表達的基因可統(tǒng)稱為冷誘導(dǎo)基因(Cold regulated gene,COR)，在低溫、干旱及ABA誘導(dǎo)的逆境脅迫中都表達，其種類繁多且存在復(fù)雜的相互作用[20-21]。目前對于CBF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究較多，張亮[22]等從仁用杏近緣物種扁桃中分離得到了AF-PdCBF1轉(zhuǎn)錄因子，推測AF-PdCBF1在扁桃冷馴化途徑中具有一定功能；在新疆野扁桃中利用染色體移步法得到了AlsCBF翻譯起始位點上游的啟動子序列，研究驗證表明該啟動子具有非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動子的功能[23]；在櫻桃中獲得了與薔薇科植物同源性較高的CBF序列，可用于進一步研究櫻桃中CBF基因的作用[24]；桃中PpCBF1基因在蘋果中的異位表達可增加其耐凍能力，抑制生長，推遲春芽萌發(fā)[25];而最新研究發(fā)現(xiàn)，在桃樹開花期施用適當濃度外源水楊酸可緩解花器官凍結(jié)，這一作用是通過調(diào)節(jié)PpCBF基因的表達模式實現(xiàn)的[26]。同時，植物中還存在其他轉(zhuǎn)錄因子也參與植物抗寒調(diào)節(jié)，長柄扁桃中克隆得到ApDREB轉(zhuǎn)錄因子，與同科植物的DREB基因具有相似功能，為果樹抗寒育種提供了新的候選基因[27]；湖北海棠中獲得的MhWRKY40b基因除與抗病相關(guān)外，還可能在湖北海棠的抗寒過程中也起重要作用[28]。另外，CBF基因的上游調(diào)控基因ICE也有研究報道，從梅中克隆得到PmICE1基因，其與ICE1同源基因具有一致性[29]。H.Shin[30]等研究桃脫水蛋白基因PpDhn在自然降溫過程中發(fā)現(xiàn),PpDhn1和PpDhn3的表達隨溫度的變化呈正相關(guān)調(diào)節(jié)。而梅中抗凍蛋白PmLEA在花器官中高度表達，并且會被ABA誘導(dǎo)上調(diào),隨后在另一研究中證實，梅PmLEA基因可多種脅迫如ABA，SA，低溫等處理誘導(dǎo)表達[31-32]。

在仁用杏抗寒性研究中，關(guān)于抗寒分子機制和抗寒基因的研究仍處于發(fā)展階段，相關(guān)研究相對較少。抗凍蛋白研究方面，利用氮離子注入技術(shù)將抗寒蛋白基因afp導(dǎo)入杏樹，發(fā)現(xiàn)變異率為100%，嫁接成活率最高為33.3%[33]。之后羅磊[34]等以3個杏樹品種的變異植株為試材，低溫脅迫處理后測定其相關(guān)生理指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異植株在抗過氧化作用、膜穩(wěn)定性等方面均高于作為對照的野生型植株。通過花粉管通道技術(shù)將沙冬青抗寒基因AmEBP1成功轉(zhuǎn)化入岱玉杏T0代中，得到轉(zhuǎn)基因株系的抗寒性>對照組培苗[35]。在之后的研究中，沙冬青抗寒基因AmEBP1又被成功轉(zhuǎn)化到‘大果’杏幼胚中，抗寒試驗結(jié)果表明，相同低溫條件下轉(zhuǎn)基因植株的成活率均比對照高；半致死溫度比對照低，從而再次證明AmEBP1基因可提高杏的抗寒性[36]。研究發(fā)現(xiàn)低溫下對杏花施用適宜濃度的外源水楊酸(SA)會誘導(dǎo)CBF轉(zhuǎn)錄基因的表達，增強杏花的抗寒性[37]。此外，T.Trainin[38]等通過研究提出，杏中的ParSOC1基因可能在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律來適應(yīng)環(huán)境的通路中起作用，同時調(diào)節(jié)杏樹需冷量打破休眠達到影響開花時間的目的，此發(fā)現(xiàn)可用于杏樹開花調(diào)節(jié)研究，間接避開晚霜危害。

4 仁用杏抗寒性研究存在問題及展望

由于果樹生長周期長，雜交不穩(wěn)定，其育種工作較難進行[39]。對于仁用杏抗寒性研究進展而言，現(xiàn)階段研究仁用杏抗寒性的主要方法是從生理、生化方面進行綜合分析和研究，而在仁用杏抗寒基因工程方面的研究仍處于發(fā)展階段。近年來，利用基因工程技術(shù)手段將外源植物抗寒基因轉(zhuǎn)入植物中，在模式植物及其他作物中都取得了很大的進展，關(guān)于木本植物抗寒基因的研究相對較為落后，用于仁用杏抗寒遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因相對較少。隨著基因工程技術(shù)的日漸成熟，利用生物技術(shù)手段對林木進行定向改良已成為趨勢。將相關(guān)抗性基因從木本植物中分離，再轉(zhuǎn)化到木本植物中，現(xiàn)在已經(jīng)成為木本植物抗性育種新的發(fā)展方向和途徑[40]。對于仁用杏這些易受冬季嚴寒和春季晚霜危害的樹種，可借鑒其他林木抗寒基因研究的經(jīng)驗，將今后的研究重點放在對于仁用杏抗寒基因及闡述引起抗寒生理生化變化的分子機制上，集中于抗凍蛋白AFP、抗寒轉(zhuǎn)錄因子、抗寒相關(guān)調(diào)控蛋白基因、抗寒基因啟動子及多基因轉(zhuǎn)化等眾多熱點和重點問題研究上，充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，探索仁用杏抗寒分子機制，篩選出適宜的抗寒相關(guān)基因，用于仁用杏抗寒育種，培育出兼?zhèn)淇鼓嫘誀詈推渌麅?yōu)良性狀的新型仁用杏品種。

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