張利慧，劉 欣，王曉峰，李積勝，陳少林

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

纖維素是維管植物細(xì)胞壁的主要成分，但在非維管植物、被囊類海洋生物和許多細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)[1-3]?；诶w維素類的生物質(zhì)能源是一種非常有前景的可再生能源[4-5]。細(xì)胞壁在植物生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用，因此纖維素合成機(jī)制的相關(guān)研究在多個學(xué)科中占重要地位[6-9]。

纖維素由定位于質(zhì)膜上的纖維素合酶復(fù)合體(CESA)合成[10]。高等植物的CESA復(fù)合體在冷凍蝕刻電鏡下呈現(xiàn)六瓣花狀結(jié)構(gòu)[11]。CESA4、CESA7、CESA8是擬南芥(Arabidopsis)次生壁合成必需的[12-15]，而CESA1和CESA3是初生壁纖維素合成必需的[12-15]。CESA2、CESA5、CESA6、CESA9在初生壁纖維素合成中存在部分功能冗余[12-15]。據(jù)推測，CESA復(fù)合體中的每個蛋白單體合成一條β-(1,4)-D-葡糖苷鏈，再聚合形成纖維素微纖絲。CESA復(fù)合體與周質(zhì)微管間存在直接的相互作用，在微管的導(dǎo)引下雙向合成纖維素微纖絲[16]。纖維素合酶互作蛋白(CSI1)和纖維素合酶伴侶蛋白(CC)參與微管和纖維素合酶復(fù)合體的相互作用[17-18]。CC蛋白具有在鹽脅迫條件下維持纖維素的合成的作用[18]。

據(jù)推測，植物CESAs在N端和C端分別有2個和6個跨膜區(qū)域 (圖1)。擬南芥CESAs的N端由160～260個氨基酸殘基組成，該區(qū)域在結(jié)構(gòu)上又被劃分成3個結(jié)構(gòu)域(圖1)[19],包括1個鋅指結(jié)構(gòu)域(Zn，大約50個氨基酸)，含2個鋅指模序(motif)和8個高度保守的半胱氨酸殘基 (Cx2Cx12FxACx2Cx2PxCx2CxEx5Gx3Cx2C)。鋅指結(jié)構(gòu)域的上游是N末端(NT)結(jié)構(gòu)域，約含8～38個氨基酸。鋅指結(jié)構(gòu)域的下游是N端的高變區(qū)(HVR1)。在2個跨膜區(qū)域之間的是中央結(jié)構(gòu)域，其中含有另一個植物特有的高變區(qū)(HVR2)。2個高變區(qū)在直系同源中相對保守，因此HVR1和HVR2又分別被命名為物種特異區(qū)C-SR1和C-SR2[20]。中央結(jié)構(gòu)域還含有另一個植物特有的保守區(qū)域(P-CR)，以及3個保守的天冬氨酸殘基和1個Q/RXXRW模序，它們可能在結(jié)合底物和催化過程中起重要作用(圖1)。

蛋白磷酸化是進(jìn)化的重要途徑，為快速、可逆的調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能提供了重要機(jī)制[21]?；谫|(zhì)譜技術(shù)的磷酸化蛋白組學(xué)研究表明，擬南芥等植物的CESAs中有多個磷酸化位點(diǎn)[22-26]。我們前期的模擬磷酸化(phosphomemetic)和去磷酸化(nonphosphorylable)的突變研究表明，擬南芥CESA1和CESA3的磷酸化是調(diào)控微管引導(dǎo)的纖維素合成與沉積以及組織特異的細(xì)胞各向異性生長的重要分子機(jī)制[27-28]。而CESA5的磷酸化則是光敏色素調(diào)控纖維素合成和下胚軸細(xì)胞伸長生長的重要機(jī)制[29]。磷酸化蛋白組學(xué)研究進(jìn)一步表明， CESAs的磷酸化修飾響應(yīng)植物生長發(fā)育及環(huán)境信號[22-26]，調(diào)控微管介導(dǎo)的纖維素合成和沉積的關(guān)鍵機(jī)制[27-29]。

植物細(xì)胞的特殊形態(tài)通常與其行使的特定功能密切相關(guān)。纖維素生物合成對于植物細(xì)胞形態(tài)建成以及發(fā)揮特定功能至關(guān)重要。本研究以擬南芥CESA為對照，對楊樹、葡萄、番茄、苜蓿以及小麥、大麥、玉米、水稻和大豆等13個物種的CESA家族成員進(jìn)行了序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)的收集和整理，分析鑒定了磷酸化位點(diǎn)在CESA家族以及物種間的保守性。本研究提供了農(nóng)林作物CESAs磷酸化位點(diǎn)演變的新見解，對于進(jìn)一步了解農(nóng)林作物的生長發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制具有重要的科學(xué)理論意義。

1 材料與方法

1.1 序列信息

CESA序列來自于TAIR (http://www.arabidopsis.org/)、GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 和JGI (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) 等數(shù)據(jù)庫。本研究用到的基因組列于表1中。

表1 基因組信息

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

CESAs的整合與分析借助于MUSCLE軟件[30]。按照極大似然法構(gòu)建CESA序列的進(jìn)化樹，由I.LETUNIC[31]等整理并展示出CESA家族序列在進(jìn)化樹中的分布。

1.3 磷酸化位點(diǎn)分析

從PhosPhAt和P3DB等磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫中提取、整理和確認(rèn)了擬南芥CESAs的磷酸化位點(diǎn)。表2為位置確定的CESAs磷酸化位點(diǎn)[22-26]。MEGA6.0用于測定磷酸化位點(diǎn)的保守程度[32]。每個磷酸化位點(diǎn)保守概率是按照絲氨酸/蘇氨酸/絡(luò)氨酸所占的百分比估算，該密度以熱圖的形式由Heml 1.0作標(biāo)準(zhǔn)化處理[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CESA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

本研究以擬南芥以及小立碗蘚和卷柏的CESA為對照，對楊樹、葡萄、番茄、苜蓿以及小麥、大麥、玉米、水稻和大豆等作物的CESA家族成員進(jìn)行了序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，CESA蛋白家族聚為7大類，包括高等植物的CESA1、CESA3和CESA6家族以及CESA4、CESA7和CESA8家族。苔蘚或石松等低等植物的CESA形成另一個家族(圖2)。前期研究表明，參與初生壁或次生壁合成的纖維素合成酶復(fù)合體需要至少3種不同的CESA蛋白[12-15]。擬南芥的CESA1、CESA3和CESA6參與初生壁纖維素微纖絲的合成，而CESA4、CESA7和CESA8參與次生壁纖維素合成[12-15]。

注:CESA蛋白包含8個跨膜區(qū)域(棕色短棒),1個N末端結(jié)構(gòu)域(NT)和1個鋅指結(jié)構(gòu)域(Zn)。在N端的胞質(zhì)區(qū)有1個高變區(qū)(HVR1)，在中央胞質(zhì)區(qū)有1個植物保守區(qū)域(P-CR)和另1個高變區(qū)(HVR2)。中央胞質(zhì)區(qū)的保守氨基酸殘基(D,D,D,QXXRW)被認(rèn)為在與底物結(jié)合的過程中起重要作用，其次就是催化過程。

圖1高等植物CESA蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.1 A schematic diagram of the higher plant CESA proteins

注：擬南芥CESAs中已鑒定出的磷酸化的絲氨酸位點(diǎn)和鋅指結(jié)構(gòu)域中保守的半胱氨酸均用灰色標(biāo)出。

2.2 CESA蛋白序列分析及其磷酸化位點(diǎn)分布

高等植物的磷酸化位點(diǎn)主要集中在3個區(qū)域，分別是氮末端結(jié)構(gòu)域(NT)以及高變區(qū)1(HVR1)和高變區(qū)2(HVR2)[22-26]。目前已發(fā)現(xiàn)的CESAs磷酸化位點(diǎn)主要集中于HVR1區(qū)域。例如，擬南芥CESA1和CESA3的HVR1區(qū)域分別含有8個和10個磷酸化位點(diǎn)[22-26]。在CESA6 和CESA6-like亞型(CESA2、5、9)中，只有CESA5被鑒定出在該區(qū)域含有磷酸化位點(diǎn)。參與次生壁合成的CESA4和CESA8的HVR1區(qū)域中也發(fā)現(xiàn)含有磷酸化位點(diǎn)(表2)。

NT區(qū)域只含有少量的磷酸化位點(diǎn)(圖2)。擬南芥CESAs的NT結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)包括CESA1的S24位點(diǎn)，CESA3的S3位點(diǎn)以及CESA2、5、6、9的S11位點(diǎn)等(表2)[22-26]。序列比對分析結(jié)果表明，S11位點(diǎn)及其兩端的序列在擬南芥的CESA6和CESA6-like(CESA2、5、9)亞基中相對保守。但是，相比于氮端的鋅指結(jié)構(gòu)域，不同CESAs的NT結(jié)構(gòu)域的保守性相對較低(圖2)。例如，相對于CESA1、CESA6以及CESA6-like，CESA3的NT結(jié)構(gòu)域的部分序列缺失，導(dǎo)致S11位點(diǎn)的缺失(表2、圖2)，表明NT結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑ESA3的功能并非必需。然而，CESA3保留或獲得了S3磷酸化位點(diǎn)。

除了NT和HVR1結(jié)構(gòu)域外，另一個高變區(qū)HVR2也發(fā)現(xiàn)含有磷酸化位點(diǎn)，然而參與次生壁合成的CESA4、7、8的HVR2結(jié)構(gòu)域中卻沒有發(fā)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)(圖1、表2)，表明初生壁和次生壁的纖維素合成調(diào)控機(jī)制可能有所不同。

表2 擬南芥中已被鑒定出的磷酸化位點(diǎn)

注：擬南芥已鑒定出的CESAs磷酸化位點(diǎn)信息來源于PhospPHAte 4.0 (http://phosphat.uni-hohenheim.de/) 和 P3DB (http://p3db.org/)數(shù)據(jù)庫。

2.3 CESA家族磷酸化位點(diǎn)的進(jìn)化

擬南芥以及作物CESAs的磷酸化位點(diǎn)主要集中在NT、HVR1和HVR2結(jié)構(gòu)域[22-26]。比較基因組學(xué)分析表明，這些結(jié)構(gòu)域已存在于苔蘚和石松類的CESAs中，但是細(xì)菌的CESAs則不含這些結(jié)構(gòu)域，表明這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥参锛?xì)胞壁的纖維素合成乃至植物的生長發(fā)育可能具有重要功能，這一預(yù)測與近期的研究結(jié)果相一致[27-28]。

在苔蘚植物小立碗蘚和石松類植物卷柏中，分別存在著至少7條和5條CESA基因。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，這些序列分別形成了各自的分支(圖3)。盡管小立碗蘚的基因組中不存在與作物CESAs同源的序列，但是擬南芥CESAs中被鑒定的磷酸化位點(diǎn)卻在小立碗蘚CESAs中保守，包括CESA1的S152、S686、S688位點(diǎn)，CESA3的S144、S211、S671、T672位點(diǎn)，CESA 2、5、6和9的S11位點(diǎn)，CESA2的S715、T718位點(diǎn)，CESA5的S126位點(diǎn)以及CESA4的S135位點(diǎn)(圖4)。另外，擬南芥CESA3的S151位點(diǎn)，CESA4的S139位點(diǎn)，CESA5的S122位點(diǎn)和CESA7的S185位點(diǎn)在小立碗蘚的CESAs中部分保守。與作物CESAs相似的是，苔蘚CESAs保守的絲氨酸/蘇氨酸/絡(luò)氨酸同樣集中于NT、HVR1和HVR2結(jié)構(gòu)域中。尤其是擬南芥CESA2的T718磷酸化位點(diǎn)，在苔蘚CESA分支和作物CESA的6大分支中都保守(圖4)。此外，擬南芥CESA1的S152位點(diǎn)，CESA2、5、6和9的S11位點(diǎn)，CESA2的S715位點(diǎn)，CESA3的S144、S211和T672位點(diǎn)，CESA4的S135位點(diǎn)，也在苔蘚的CESAs中保守，但只在少數(shù)初生壁或次生壁的CESA分支里保守(圖4)。另一方面，CESA1的S686、S688位點(diǎn)和CESA3的S671位點(diǎn)只在初生壁相關(guān)的CESA1或CESA3分支中保守，而CESA4的S139位點(diǎn)除了在苔蘚CESA分支中相對保守之外，還在次生壁相關(guān)的CESA4和CESA8分支中保守。然而，擬南芥CESA5的S126磷酸化位點(diǎn)在苔蘚CESA分支和CESA8分支中保守。

擬南芥CESAs中的一些磷酸化位點(diǎn)在苔蘚的CESAs分支中并不保守，包括CESA1的S134、S162、S167、S180位點(diǎn)，CESA3的Y169、S176、T212、S216、S226位點(diǎn)，CESA5的T124、S229、S230位點(diǎn)，CESA4的S136、S374位點(diǎn)，以及CESA7的S181位點(diǎn)。這些氨基酸殘基全都集中在HVR1區(qū)域，可能在作物CESA的進(jìn)化中有重要作用。

3 結(jié)論與討論

模擬磷酸化和去磷酸化突變研究表明[27-28]，CESA1和CESA3的HVR1和HVR2區(qū)域的部分磷酸化位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化顯著影響纖維素的生物合成以及細(xì)胞的伸長生長，表明HVR1和HVR2結(jié)構(gòu)域的磷酸化在調(diào)節(jié)纖維素的合成和沉積以及細(xì)胞形態(tài)建成中發(fā)揮著重要作用[27-28]。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)合CESA磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)的收集和整理[34]，本研究分析鑒定了CESA磷酸化位點(diǎn)在作物CESA家族中的保守性。結(jié)果表明，作物的初生壁CESA1、CESA3和CESA6-like家族的一些磷酸化位點(diǎn)在擬南芥CESA家族中以及苔蘚和石松CESA家族中均高度保守，表明這些CESAs位點(diǎn)的磷酸化修飾可能是作物初生壁纖維素合成的一種相對保守和具有重要功能的分子調(diào)控機(jī)制。CESAs的N端的鋅指結(jié)構(gòu)域已被認(rèn)定參與介導(dǎo)蛋白和蛋白的相互作用。例如，水稻CESA7鋅指結(jié)構(gòu)域的一個錯義突變影響植物生長和纖維素的生物合成，表明該結(jié)構(gòu)域?qū)w維素合酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用[35]。CESAs的HVR1結(jié)構(gòu)域以及NT結(jié)構(gòu)域均靠近鋅指結(jié)構(gòu)域，可能對纖維素合酶復(fù)合體內(nèi)蛋白互作有重要意義[36-37]。HVR1位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域以及NT結(jié)構(gòu)域的磷酸化可能通過影響CESA復(fù)合體內(nèi)蛋白互作，參與調(diào)控微管引導(dǎo)的纖維素合成與沉積[27-28]。

棉花CESA1中央結(jié)構(gòu)域的計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，在CESA裝配成大的復(fù)合體時需要HVR2結(jié)構(gòu)域的參與[38]。HVR2結(jié)構(gòu)域的磷酸化可能是纖維素合酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)與功能的另一種調(diào)控機(jī)制[27-28]。模擬磷酸化和模擬去磷酸化突變研究結(jié)果表明，與CESA1和CESA3的HVR1結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)突變體的表型相似[27-28]，CESA1的S686和S688位點(diǎn)的磷酸化也參與調(diào)控細(xì)胞的各向異性生長，說明位于HVR1和HVR2區(qū)域的磷酸化位點(diǎn)在調(diào)控纖維素生物合成的過程中有類似的功能[27-28]，它們的調(diào)控功能是否有差異還有待進(jìn)一步研究。

初生壁CESA基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平相對較高，且差異不大，被認(rèn)為是管家(house-keeping)基因[10]。與初生壁的纖維素合成不同，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控對于次生壁的纖維素合成可能具有更為重要的作用[17]。參與次生壁纖維素合成的CESAs也有多個磷酸化位點(diǎn)[22-26]，作物的CESA4家族的部分磷酸化位點(diǎn)在擬南芥CESA4家族以及苔蘚和石松CESA家族中也具有高度保守性，表明除了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控外，次生壁CESA的磷酸化修飾可能同時是次生壁纖維素合成的重要分子調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步研究CESA磷酸化在農(nóng)林作物中的調(diào)控功能和機(jī)制，對于了解作物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)以及提高作物產(chǎn)量，都具有非常重要的科學(xué)理論意義。

注：通過MUSCLE軟件對多序列進(jìn)行在線比對整合構(gòu)樹，圓形有根樹由ITOL軟件展示。CESA家族蛋白序列被分成多個分支，相當(dāng)于擬南芥初生壁的CESA1、CESA3、 CESA6和次生壁的CESA4、CESA7、 CESA8。

圖3陸生植物纖維素合酶的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3 Phylogeny of the cellulose synthase family in land plants

注：表2中擬南芥磷酸化位點(diǎn)在CESA的每個分支都計(jì)算了絲氨酸/蘇氨酸的保守比例。通過Heml1.0對該比例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并繪制熱圖。

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