(1 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)血液內(nèi)科，湖北 黃石 435000； 2 武漢市協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)作為一種兒童時(shí)期常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是由于骨髓中的原始幼稚細(xì)胞發(fā)生克隆性異常增殖并抑制正常造血功能導(dǎo)致的，嚴(yán)重威脅兒童生命健康[1-2]。目前，隨著臨床上ALL化療技術(shù)的不斷進(jìn)展，多數(shù)病兒預(yù)后比較良好，但是仍有20%～30%的病兒化療后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3-5]，而復(fù)發(fā)病兒再次化療緩解率較低，預(yù)后不佳[6]。因此，積極探討影響ALL復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制對(duì)改善病兒預(yù)后具有重要意義。胞裂蛋白(Septin)作為一種進(jìn)化上高度保守的具有GTPase活性的基因家族，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[7]。Septin-9是Septin家族的重要成員，有研究表明，Septin-9參與了多種惡性腫瘤惡性化過程，且與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)[8]。本研究擬觀察ALL病兒骨髓組織中Septin-9表達(dá)的變化，并分析Septin-9表達(dá)變化對(duì)ALL細(xì)胞增殖和侵襲力的影響，以探討其在兒童ALL發(fā)病機(jī)制中的作用，并為臨床上的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月—2017年8月在我院門診就診或住院治療的ALL病兒共94例，其中初診病兒63例，男37例，女26例，年齡1.4～14.2歲，平均(6.4±2.8)歲；包括急性B系淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)44例和急性T系淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)19例；根據(jù)中國兒童血液病研究組2008方案組(CCLG-08組)分組標(biāo)準(zhǔn)分為標(biāo)危組17例，中危組22例，高危組24例。緩解病兒20例，男11例，女9例，年齡2.5～13.4歲，平均(7.7±3.6)歲。復(fù)發(fā)病兒11例，其中男7例，女4例，年齡1.8～14.5歲，平均(7.7±4.3)歲。另選取同時(shí)期進(jìn)行骨骼矯治手術(shù)的病兒16例作為對(duì)照組，其中男9例，女7例，年齡2.7～12.8歲，平均(7.2±3.1)歲；均排除血液系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤。各組病兒性別、年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。

1.2 主要試劑和設(shè)備

淋巴細(xì)胞分離液購自中科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；人Jurkat細(xì)胞系購自上海中喬新舟生物科技公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Trizol總RNA提取試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；Septin-9和內(nèi)參序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；Septin-9干擾序列和陰性對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成；兔抗人Septin-9多克隆抗體購買自美國Santa Cruz公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)液和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購買于南京凱基生物科技發(fā)展公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購買于美國BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠電泳分析系統(tǒng)購買于日本Kodark公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象均抽取新鮮骨髓樣品2～5 mL，肝素抗凝，加入淋巴細(xì)胞分離液；用離心機(jī)2 000 r/min離心25 min，留取界面層單個(gè)核細(xì)胞，PBS沖洗2次，計(jì)數(shù)并分裝于無菌離心管內(nèi)，于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA表達(dá) 按照Trizol總RNA提取試劑盒說明完成操作，提取單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，利用BIO分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度和濃度進(jìn)行檢測，以A260/A280在1.80～2.20且濃度≥200 mg/L為合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，以cDNA為模板，按照PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下。Septin-9上游引物：5′-CCAAGTGACCAGGGAAGTGT-3′，下游引物：5′-AAGGCACGGGTAGATCAACAG-3′，GAPDH上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAG-ACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAA-TCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s，循環(huán)38次，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將Jurkat細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為0.01胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后胰酶消化，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于24孔板中，細(xì)胞濃度2×108個(gè)/L。用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染：①Septin-9干擾組(C組)：轉(zhuǎn)染Septin-9小分子RNA干擾序列，正義鏈：5′-AGGCGUACCGUG-UGAAGCGCCUCAA-3′，反義鏈：5′-UUGAGGC-GCUUCACACGGUACGCCU-3′；②陰性對(duì)照組(B組)：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列，正義鏈：5′-TTTGCGCTC-TTCGGATCTTTAGCTCTTGATATCCGGAGCT-AAAGATCCGAAGAGTTTTTT-3′，反義鏈：5′-C-TAGAAAAAACTCTTCGGATCTTTAGCTCCG-GATATCAAGAGCTAAAGATCCGAAGAGCG-3′；③空白組(A組)：不作任何處理。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后恒溫培養(yǎng)48 h，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4Western blot方法檢測各組細(xì)胞中Septin-9蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解，用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中總蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測。行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，將膜在含有50 g/L脫脂奶粉的PBS中封閉60 min。加入一抗(稀釋比例1∶800)，4 ℃孵育過夜；洗膜3次，加入二抗，室溫孵育120 min；洗膜3次，暗室下用化學(xué)發(fā)光試劑顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參照，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析，以獲得目的蛋白條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取各組細(xì)胞，胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，密度為5×109個(gè)/L。取200 μL單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，恒溫培養(yǎng)，于37 ℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)0.05的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，向各孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，各孔加入DMSO液150 μL，充分振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度A值。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗3次，室溫下1 000 r/min離心6 min；棄上清液，4 ℃下用冰乙醇過夜固定；室溫下1 000 r/min離心6 min，棄乙醇，PBS沖洗2次。根據(jù)試劑盒說明操作，加入RNase A，室溫下靜置1 h，后以1 000 r/min離心6 min；棄上清液，加入碘化丙啶(PI)500 μL，避光反應(yīng)0.5 h；上機(jī)檢測2×104個(gè)細(xì)胞，用CellQuest軟件對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.3.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取各組細(xì)胞，胰酶消化，離心留取細(xì)胞沉淀，按5×104/孔細(xì)胞接種于6孔板。待細(xì)胞鋪滿皿底后，用移液槍槍頭垂直于孔板盡量畫直線，用PBS沖洗3次，加入不含血清的培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)，于37 ℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、24和48 h時(shí)拍照，計(jì)算劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h/48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.8Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel基質(zhì)膠稀釋后平鋪于Transwell上室，4 ℃風(fēng)干備用。取各組細(xì)胞，胰酶消化，離心留取細(xì)胞沉淀，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個(gè)/L。取200 μL細(xì)胞懸液加入小室上室，將500 μL含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的培養(yǎng)液加入小室下室，置于37 ℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，將小室取出，以40 g/L的甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS沖洗3次，用棉簽輕輕將散落的細(xì)胞去除，顯微鏡下觀察并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 初診病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9表達(dá)

初診病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.77±0.33，高于對(duì)照組的1.15±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.283，P<0.05)；初診病兒中，B-ALL和T-ALL病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.74±0.34和1.82±0.29，差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.812，P>0.05)。標(biāo)危組、中危組和高危組病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.42±0.17、1.72±0.14和2.05±0.21，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=108.770，P<0.05)。

2.2 不同病程病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9的表達(dá)

初診病兒、緩解病兒和復(fù)發(fā)病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.77±0.33、1.37±0.07和2.26±0.16，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.456，P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞中Septin-9蛋白表達(dá)

C、B和A組細(xì)胞中Septin-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.06、0.75±0.11和0.86±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.232，P<0.05)；B組和A組細(xì)胞中Septin-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無顯著性(t=1.846，P>0.05)；C組細(xì)胞中Septin-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于B、A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.719、12.159，P<0.05)。見圖1。

A：A組；B：B組；C：C組。

2.4 各組細(xì)胞增殖能力比較

C、B和A組24、48、72和96 h細(xì)胞增殖能力比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.349～32.761，P<0.05)；B組和A組24、48、72和96 h細(xì)胞增殖能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組24、48、72和96 h細(xì)胞增殖能力低于B、A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.842～48.371，P<0.05)。見表1。

2.5 各組細(xì)胞周期的變化

C、B和A組G0/G1期和S期細(xì)胞比例比較差異均具有顯著性(F=7.887、8.148，P<0.05)；B組和A組G0/G1期和S期細(xì)胞比例比較差異無顯著性(t=0.365、0.874，P>0.05)；C組G0/G1期細(xì)胞比例高于B組和A組，而S期細(xì)胞比例低于B組和A組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.112～4.157，P<0.05)；C、B和A組G2/M期細(xì)胞比例比較差異無顯著性(F=0.785，P>0.05)。見表2、圖2。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較

表2 各組細(xì)胞周期變化

2.6 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C、B和A組24和48 h劃痕愈合率比較差異具有顯著性(F=42.444、97.442，P<0.05)。B組和A組24和48 h劃痕愈合率比較差異無顯著性(t=0.583、0.972，P>0.05)，C組24和48 h劃痕愈合率低于B、A組，差異具有顯著意義(t=7.299～13.964，P<0.05)。結(jié)果見表3和圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C、B和A組侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異有顯著性(F=66.073，P<0.05)；B組和A組侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無顯著性(t=1.287，P>0.05)；C組侵襲細(xì)胞數(shù)低于B、A組，差異具有顯著性(t=11.062、9.496，P<0.05)。見表3和圖4。

表3 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

3 討 論

白血病是導(dǎo)致兒童期病兒死亡的常見的惡性腫瘤之一，其中以ALL最為常見，約占白血病類型的75%以上[9-10]。目前，隨著化療方案的不斷優(yōu)化，兒童ALL總體5年無事件生存率約為90%[11-12]；但仍有部分病兒最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)病兒再次緩解失敗風(fēng)險(xiǎn)高、生存時(shí)間縮短，預(yù)后極差[13-16]。因此，發(fā)現(xiàn)和確定兒童ALL發(fā)生、進(jìn)展及復(fù)發(fā)相關(guān)的高危mRNA，對(duì)指導(dǎo)治療及提供治療靶點(diǎn)具有重要意義。Septin-9 mRNA位于人染色體17q25.3，在細(xì)胞質(zhì)分裂、細(xì)胞極化、細(xì)胞膜重構(gòu)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[17-18]；Septin-9是潛在的原癌基因，其異常表達(dá)可引起細(xì)胞極性丟失、形態(tài)改變，增加了細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)[19-21]；且與腫瘤細(xì)胞異常增殖及凋亡密切相關(guān)[22-23]?，F(xiàn)有研究表明，Septin-9在乳腺癌、人腎細(xì)胞癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常[21，24-26]。本研究結(jié)果顯示，初診病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，說明Septin-9 mRNA在ALL病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)異常增加，可能參與了ALL發(fā)?。煌瑫r(shí)，隨著臨床危險(xiǎn)度分級(jí)升高，Septin-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，提示Septin-9 mRNA表達(dá)與危險(xiǎn)度分級(jí)有關(guān)，可作為評(píng)估ALL病兒危險(xiǎn)度分級(jí)的指標(biāo)。本研究結(jié)果還顯示，復(fù)發(fā)病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Septin-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于初診和緩解病兒，且初診病兒高于緩解病兒。說明Septin-9在ALL病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)與病兒治療效果有關(guān)。

為進(jìn)一步觀察Septin-9對(duì)ALL細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究利用小分子RNA干擾技術(shù)特異性抑制人Jurkat細(xì)胞中Septin-9 mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，C組細(xì)胞中Septin-9蛋白相對(duì)表達(dá)量低于B、A組，提示C組細(xì)胞中Septin-9 mRNA表達(dá)被成功抑制。本研究結(jié)果顯示，C組24、48、72和96 h細(xì)胞增殖能力低于B、A組，表明特異性抑制了人Jurkat細(xì)胞中Septin-9 mRNA表達(dá)，可有效抑制細(xì)胞增殖，提示Septin-9可能參與了細(xì)胞增殖過程[27]。

A：A組；B：B組；C：C組。

圖2各組細(xì)胞周期的變化

A：A組；B：B組；C：C組。

A：A組；B：B組；C：C組，結(jié)晶紫染色，200倍。

細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，C組G0/G1期細(xì)胞比例高于B、A組，而S期細(xì)胞比例低于B、A組，表明抑制Septin-9 mRNA表達(dá)可抑制細(xì)胞周期由G0/G1期轉(zhuǎn)化為S期，提示Septin-9可能通過改變細(xì)胞周期而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[28-29]。本研究結(jié)果顯示，C組24 和48 h劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)均低于B、A組，表明抑制Septin-9 mRNA表達(dá)可有效抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力[30]，提示Septin-9可能參與了人Jurkat細(xì)胞遷移和侵襲過程。

綜上所述，Septin-9在ALL病兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與臨床危險(xiǎn)度分級(jí)和復(fù)發(fā)有關(guān)，特異性抑制人Jurkat細(xì)胞中Septin-9 mRNA表達(dá)，可能通過改變細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖；同時(shí)，可抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，有望為ALL發(fā)病機(jī)制研究及mRNA靶向治療提供新的靶點(diǎn)。